Biologiska klockor

Den alternerande växlingen av dag och natt i jordens cykel är så tillförlitlig att det inte är förvånande att djur, växter och bakterier anpassar sitt beteende och sin fysiologi (för en översikt, se ref. 1). Cirkadiska rytmer är en allestädes närvarande anpassning hos alla organismer till de mest förutsägbara miljöutmaningarna. En biologisk rytm som kvarstår under konstanta förhållanden och har en period på ≈1 dag kallas ”cirkadisk” (circa, ”runt”; dian, ”dag”).

Till alldeles nyligen har de molekyler som ligger till grund för oscillationen förblivit okända. Störningar av sådana oscillationer genom hämmare av RNA- eller proteinsyntesen tyder på att sådana molekyler är inblandade (2).

En metod som har varit framgångsrik när det gäller att avslöja mekanismerna är användningen av genetiska förändringar. De första och andra klockmutanter som upptäcktes i fruktflugan, Drosophila melanogaster, är period- och tidlösa gener (3-5).

I fruktflugor cyklar överflödet av mRNA- och proteinprodukter från period- och tidlösa gener under ≈24 timmar på specifika platser i flugans hjärna (6). Maki Kaneko et al. talade om dessa förmodade pacemakerceller i fruktflughjärnan genom att använda dessa molekylära svängningar som en markör (7). I det vuxna huvudet visade proteinstudier att per uttrycks rytmiskt på specifika platser, de laterala neuronerna som ligger mellan den centrala hjärnan och de optiska loberna. De laterala neuronerna anses vara de förmodade pacemakercellerna för den vuxna flugans locomoteraktivitetsrytm.

Kaneko et al. (7) visade att produkterna av per och tim kan påvisas i ett begränsat antal neuroner i larvhjärnan. Uttrycksmönstret i flera sådana celler är cykliskt. Bland dessa neuroner uttrycker fem lateralt belägna celler. PERIOD (PER) från det tidiga larvstadiet, vilket tyder på att de kan vara ansvariga för larvens tidsbestämning av eklosion och locomoteraktivitet. Ett annat intressant fynd är ett kluster av neuroner med cykliskt uttryck av per och tim i antifas till de laterala neuronerna. Resultaten tyder på att det finns flera oscillatorer som är involverade i rytmer för olika fysiologiska eller beteendemässiga processer i en enda organism. Kaneko et al. (7) beskrev också den anatomiska karakteriseringen av pacemakerneuronernas ledningsmönster med hjälp av per-promotorberoende reportergenuttryck. En sådan molekylär anatomisk metod bör ge en ny insikt i den funktionella kartläggningen av detta hjärnsystem. Dessutom bör jämförelsen mellan klockceller från däggdjur och flugor klargöra det evolutionära förhållandet mellan dessa system.

Den cirkadiska kontrollen av transkriptionen ger en ingångspunkt för att analysera de cis-verkande reglerande element och trans-verkande faktorer genom vilka klockan kan reglera många klockstyrda genuttryck (6). Dessa förmodade cis-verkande regleringselement, som kallas ”time-box” (8), antas vara belägna i promotor- och enhancerregionen för klockstyrda gener. Dessutom kan det klockstyrda responsiva elementet (6) eller time-boxen reglera de endogena cirkadiska fysiologiska fenomenen under konstanta förhållanden. Nyligen har en möjlig kandidat för time-box identifierats i promotorregionen för Drosophilas periodgen (9). Även om per har föreslagits förmedla mRNA-cykling genom transkriptionell repression är en direkt interaktion mellan per och DNA mycket osannolik på grund av avsaknaden av en DNA-bindande domän i PER. Hardins grupp har utförligt analyserat promotorregionen för per-genen i studier med hjälp av transgena flugor med per-lacZ-fusionsgen (9). De identifierade en cirkadisk transkriptionsförstärkare inom ett 69-bp DNA-fragment som innehåller en E-box uppströms per-genen och som är ansvarig för den nattliga aktiveringen av per-genens uttryck. E-boxen är en känd bindningsplats för klassen basic helix-loop-helix av transkriptionsfaktorer.

Den hittills starkaste kandidaten för en trans-verkande faktor i oscillatorn är Clock, som klonats med hjälp av en forward-genetisk strategi (10). Takahashis grupp (10) isolerade och analyserade locomoteraktiviteten hos cirkadiska muterade musstammar. Clock-mutanten uppvisade lång period som blev arytmisk efter flera dagar i konstant mörker. Takahashi och kollegor (10) klonade framgångsrikt den ansvariga genen och identifierade mutationen i den proteinkodande regionen av Clock-genen. Intressant nog innehåller Clock-proteinet en protein-proteinbindningsdomän (PAS) som finns i Drosophila per-genen och ett basic helix-loop-helix-motiv för DNA-bindning. Dessutom kunde Takahashi och kollegor (10) helt rädda den långa perioden och den arytmiska fenotypen hos klocka-muterade möss genom överföring av den normala klocka-genen.

Ravi Allada et al. beskrev de gemensamma molekylära komponenterna med fokus på Clock, som är ansvarig för genereringen av den cirkadiska rytmen hos både flugor och människor (11). Allada och hans kollegor (11) screenade kemiskt mutageniserade flugor för att leta efter mutanter som förändrar eller upphäver den cirkadiska rytmen i locomoteraktiviteten och hittade en ny arytmisk mutant, som inledningsvis kallades Jrk. Jrk-flugor uttrycker låga nivåer av period- och tidlösa proteiner på grund av minskade transkriptionsnivåer. Genen identifierades och uppvisar en slående sekvenskonservering med däggdjurens gen för cirkadisk rytm, Clock; Allada et al. (11) döpte därför om denna fluggen till dClock. Liksom musens klocka innehåller Drosophilas klocka grundläggande helix-loop-helix- och PAS-domäner samt en transkriptionsaktiveringsdomän.

Nyligen utförda arbeten från både däggdjur och flugor tyder på att CLOCK:s proteinpartners också är evolutionärt konserverade (benämnda BMAL) (12, 13). CLOCK-BMAL dimmers visades binda till promotorregionen för period- och tidlösa gener och transaktivera båda generna hos flugor. Dessutom undertrycker PERIOD-TIMELESS (PER-TIM)-uttryck CLOCK-BMAL-medierad reporterinduktion. Således har en negativ återkopplingsmodell föreslagits (fig. 1).

I däggdjur anses SCN i hypotalamus vara en viktig pacemaker för cirkadiska rytmfenomen, vilket har visats genom många anatomiska och fysiologiska studier (14). Nyligen rapporterades tre homologer till Drosophilas periodgen i mus och människa (15). Trots förekomsten av tre däggdjurshomologer för period som visar mRNA-cirkadisk oscillation i suprachiasmatiska kärnan i mushjärnan har ingen funktionell implikation av cirkadiskt lokomoterbeteende rapporterats.

För att klargöra om däggdjurens perhomolog kan vara involverad i den cirkadiska rytmen av locomoterbeteende hos däggdjur har Ishidas grupp klonat en perhomolog hos råttor och gjort arytmiska SCN-lesionerade råttor för att övervaka cirkadiska rytmer i perifera vävnader (16).

För att testa om rytmiskt uttryck av rat PERIOD 2 (RPER2) mRNA observeras i andra vävnader än SCN utfördes Northern blot-analyser på vävnader från öga, hjärna, hjärta, lunga mjälte, lever och njurar. Intressant nog visade alla testade vävnader ett rytmiskt uttryck av RPER2 mRNA, även om förhållandet natt/dag var olika i varje vävnad. RPER2 beter sig som en däggdjurshomolog till Drosophilas periodgen (16) eftersom dess cirkadiska uttryck var högt nattetid i en mängd olika vävnader, precis som period är i Drosophila.

Då SCN anses vara en pacemaker för den cirkadiska klockan hos däggdjur, testade Ishidas grupp (16) om det cirkadiska uttrycket i flera olika vävnader av RPER2 mRNA påverkas av en SCN-skada. Överraskande nog upphävdes den rytmiska karaktären hos det multipla vävnadsuttrycket av RPER2 helt och hållet av SCN-skadan. RPER2-uttrycket i flera vävnader kontrolleras därför av SCN. Detta är den första rapporten som visar att cirkadisk rytm i flera vävnader styrs av en hjärnklocka hos däggdjur, SCN i hypotalamus. Uppgifterna tyder också på att en däggdjurs per homolog (RPER2) kan vara involverad i den cirkadiska rytmen för lokomoterbeteende hos däggdjur, eftersom förlust av cirkadiskt uttryck av RPER2 mRNA i hela kroppen inträffade när den cirkadiska lokomoteraktiviteten hos råttor försvann. För att klargöra ett sådant problem måste vi göra transgena djur som har en loss-of-function- eller gain-of-function-mutation i RPER2-genen. Det faktum att det rytmiska uttrycket av RPER2 mRNA i flera vävnader är helt beroende av SCN tyder på att vissa signaler behövs för att upprätthålla hela kroppens rytm på ett samordnat sätt (fig. 2). En SCN-transplantationsstudie tyder också på betydelsen av humorala faktorer från SCN (17). Sådana humoralfaktorer från SCN kan vara viktiga för att generera det cirkadiska rytmiska uttrycket av RPER2-genen i perifera vävnader. Det verkar alltså, precis som i fallet med utvecklingsbiologi, som om nyckelmolekylerna i denna biologiska klocka är väl bevarade mellan flugor och däggdjur. En gemensam molekylär klockmekanism från bakterier (18) till människor kan tänkas finnas inom en nära framtid.

.