Bisulfitsekvensering

Bisulfitsekvensering tillämpar rutinmässiga sekvenseringsmetoder på bisulfitbehandlat genomiskt DNA för att bestämma metyleringsstatus vid CpG-dinukleotider. Andra strategier utan sekvensering används också för att undersöka metyleringen vid specifika loci eller på en genomövergripande nivå. Alla strategier utgår från att den bisulfitinducerade omvandlingen av ometylerade cytosiner till uracil är fullständig, och detta tjänar som grund för alla efterföljande tekniker. Helst skulle den metod som används bestämma metyleringsstatusen separat för varje allel. Alternativa metoder till bisulfitsekvensering är bland annat Combined Bisulphite Restriction Analysis och Methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP).

Metoder för att analysera bisulfitbehandlat DNA utvecklas kontinuerligt. För att sammanfatta dessa metoder som utvecklas snabbt har många översiktsartiklar skrivits.

Metoderna kan generellt delas in i strategier som bygger på metyleringsspecifik PCR (MSP) (figur 4) och strategier som använder polymeraskedjereaktion (PCR) som utförs under icke-metyleringsspecifika förhållanden (figur 3). Microarray-baserade metoder använder PCR baserad på icke-metyleringsspecifika förhållanden också.

Icke-metyleringsspecifika PCR-baserade metoderEdit

Figur 3: Metoder för analys av DNA-metylering som inte baseras på metyleringsspecifik PCR. Efter bisulfitkonvertering amplifieras det genomiska DNA:t med PCR som inte skiljer mellan metylerade och icke-metylerade sekvenser. De många tillgängliga metoderna används sedan för att göra distinktionen utifrån förändringarna inom amplikonen till följd av bisulfitkonverteringen.

Direkt sekvenseringEdit

Den första rapporterade metoden för metyleringsanalys med hjälp av bisulfitbehandlat DNA använde sig av PCR och standard dideoxynukleotid-DNA-sekvensering för att direkt bestämma de nukleotider som är resistenta mot bisulfitkonvertering. Primerna är utformade för att vara både strängspecifika och bisulfitspecifika (dvs. primer som innehåller cytosiner som inte är CpG så att de inte är komplementära till icke-bisulfitbehandlat DNA) och som flankerar (men inte inbegriper) den aktuella metyleringsplatsen. Den kommer därför att amplifiera både metylerade och icke-metylerade sekvenser, till skillnad från metyleringsspecifik PCR. Alla platser med ometylerade cytosiner visas som thymin i den resulterande amplifierade sekvensen av sense-strängen och som adeniner i den amplifierade antisense-strängen. Genom att införliva höggenomsnittsadaptrar för sekvensering i PCR-primrarna kan PCR-produkterna sekvenseras med massivt parallell sekvensering. Alternativt, och arbetsintensivt, kan PCR-produkten klonas och sekvenseras. Nested PCR-metoder kan användas för att förbättra produkten för sekvensering.

Alla efterföljande tekniker för analys av DNA-metylering med hjälp av bisulfitbehandlat DNA bygger på denna rapport av Frommer et al. (figur 2). Även om de flesta andra modaliteter inte är riktiga sekvenseringsbaserade tekniker används termen ”bisulfitsekvensering” ofta för att beskriva bisulfitkonverterade DNA-metyleringsanalysmetoder i allmänhet.

PyrosequencingEdit

Pyrosequencing har också använts för att analysera bisulfitbehandlat DNA utan att använda metyleringsspecifik PCR. Efter PCR-amplifiering av den aktuella regionen används pyrosekvensering för att bestämma den bisulfitkonverterade sekvensen av specifika CpG-platser i regionen. Förhållandet mellan C och T på enskilda platser kan bestämmas kvantitativt baserat på mängden C och T inkorporering under sekvensförlängningen. Den största begränsningen för denna metod är kostnaden för tekniken. Pyrosekvensering gör det dock möjligt att utvidga den till screeningmetoder med hög genomströmning.

En ytterligare förbättring av denna teknik beskrevs nyligen av Wong m.fl. som använder allelspecifika primers som införlivar polymorfismer med enstaka nukleotid i sekvensen i sekvenseringsprimerset, vilket gör det möjligt att göra en separat analys av maternella och paternella alleler. Denna teknik är särskilt användbar för analys av genomisk prägling.

Metyleringskänslig enkelsträngskonformitetsanalys (MS-SSCA)Edit

Denna metod bygger på SSCA-metoden (single-strand conformation polymorphism analysis) som utvecklats för analys av enkelsträngspolymorfism (SNP). SSCA skiljer mellan enkelsträngade DNA-fragment av identisk storlek men med olika sekvenser baserat på differentiell migration i icke-denaturerande elektrofores. I MS-SSCA används detta för att skilja mellan bisulfitbehandlade, PCR-amplifierade regioner som innehåller CpG-platser av intresse. Även om SSCA saknar känslighet när endast en enda nukleotidskillnad föreligger, gör bisulfitbehandlingen ofta ett antal omvandlingar från C till T i de flesta regioner av intresse, och den resulterande känsligheten närmar sig 100 %. MS-SSCA ger också en semikvantitativ analys av graden av DNA-metylering baserat på förhållandet mellan bandintensiteterna. Denna metod är dock utformad för att bedöma alla CpG-platser som helhet i den aktuella regionen snarare än enskilda metyleringsställen.

Smältningsanalys med hög upplösning (HRM)Edit

En annan metod för att skilja konverterat från okonverterat bisulfitbehandlat DNA är att använda smältningsanalys med hög upplösning (HRM), en kvantitativ PCR-baserad teknik som ursprungligen var utformad för att särskilja SNPs. PCR-amplikonerna analyseras direkt genom temperaturrampning och den resulterande frisättningen av ett interkalerande fluorescerande färgämne under smältningen. Metyleringsgraden, som representeras av C-to-T-innehållet i amplikonen, avgör hur snabbt smältningen sker och hur snabbt färgämnet frigörs. Denna metod möjliggör direkt kvantifiering i en analys i ett enda rör, men bedömer metylering i den amplifierade regionen som helhet snarare än på specifika CpG-platser.

Methyleringskänslig primerförlängning av enskilda nukleotider (MS-SnuPE)Edit

MS-SnuPE använder den primerförlängningsmetod som ursprungligen utformades för att analysera polymorfier av enskilda nukleotider. DNA:t konverteras till bisulfit och bisulfitspecifika primers anneals till sekvensen upp till basparet omedelbart före CpG:t av intresse. Primern tillåts sträcka sig ett baspar in i C (eller T) med hjälp av dideoxynukleotider som avslutas av DNA-polymeras, och förhållandet mellan C och T bestäms kvantitativt.

Ett antal metoder kan användas för att bestämma detta C:T-förhållande. I början förlitade sig MS-SnuPE på radioaktiva ddNTPs som rapportör för primerförlängningen. Fluorescensbaserade metoder eller pyrosekvensering kan också användas. Analys av masspektrometri med MALDI-TOF (matrixassisterad laserdesorptionsjonisering/time-of-flight) för att skilja mellan de två polymorfa primerförlängningsprodukterna kan dock användas, i huvudsak baserat på GOOD-analysen som är utformad för SNP-genotypering. Ionpar-omvänd fas-vätskekromatografi med hög prestanda (IP-RP-HPLC) har också använts för att skilja primerförlängningsprodukterna åt.

Basspecifik klyvning/MALDI-TOFEdit

En nyligen beskriven metod av Ehrich et al. drar ytterligare nytta av bisulfitkonverteringar genom att lägga till ett basspecifikt klyvningssteg för att öka den information som erhålls från nukleotidförändringarna. Genom att först använda in vitro-transkription av den intressanta regionen till RNA (genom att lägga till en RNA-polymeras-promotorplats till PCR-primern i den första amplifieringen) kan RNas A användas för att klyva RNA-transkriptet på basspecifika platser. Eftersom RNas A klyver RNA specifikt vid cytosin- och uracil-ribonukleotider, uppnås basspecificitet genom att man lägger till klyvningsresistent dTTP när cytosinspecifik (C-specifik) klyvning önskas, och genom att man lägger till dCTP när uracil-specifik (U-specifik) klyvning önskas. De klyvda fragmenten kan sedan analyseras med MALDI-TOF. Bisulfitbehandling resulterar antingen i att klyvningsställen införs eller avlägsnas genom omvandling från C till U eller att fragmentmassan förskjuts genom omvandling från G till A i den amplifierade bakre strängen. C-specifik klyvning skär specifikt vid alla metylerade CpG-platser. Genom att analysera storleken på de resulterande fragmenten är det möjligt att bestämma det specifika mönstret för DNA-metylering av CpG-platser inom regionen, snarare än att bestämma omfattningen av metylering av regionen som helhet. Denna metod har visat sig vara effektiv för screening med hög genomströmning, vilket gör det möjligt att förhöra många CpG-platser i flera vävnader på ett kostnadseffektivt sätt.

Metyleringsspecifik PCR (MSP)Edit

Figur 4: Metyleringsspecifik PCR är en känslig metod för att på ett diskriminerande sätt amplifiera och detektera en metylerad region av intresse med hjälp av metyleringsspecifika primers på bisulfitkonverterat genomiskt DNA. Sådana primers kommer endast att annealera till sekvenser som är metylerade och därmed innehåller 5-metylcytosiner som är resistenta mot omvandling av bisulfit. Alternativt kan man använda icke-metylerade specifika primers.

Denna alternativa metod för metyleringsanalys använder också bisulfitbehandlat DNA men undviker behovet av att sekvensera området av intresse. Istället utformas primerparen själva för att vara ”metylatspecifika” genom att inkludera sekvenser som endast kompletterar okonverterade 5-metylcytosiner, eller tvärtom ”ometylatspecifika”, som kompletterar thyminer som konverterats från ometylerade cytosiner. Metyleringen bestäms av den specifika primerns förmåga att åstadkomma amplifiering. Denna metod är särskilt användbar för att undersöka CpG-öar med eventuellt hög metyleringstäthet, eftersom ett ökat antal CpG-par i primern ökar testets specificitet. Genom att placera CpG-paret i 3′-ändan av primern förbättras också känsligheten. I den första rapporten om användning av MSP beskrevs tillräcklig känslighet för att upptäcka metylering av 0,1 % av allelerna. I allmänhet anses MSP och relaterade protokoll vara de känsligaste när man frågar ut metyleringsstatusen på ett specifikt locus.

MethyLight-metoden bygger på MSP, men ger en kvantitativ analys med hjälp av kvantitativ PCR. Metyleringsspecifika primers används, och en metyleringsspecifik fluorescensreportersond används också som annealiseras till den amplifierade regionen. Alternativt kan primrarna eller sonden utformas utan metyleringsspecificitet om diskriminering behövs mellan CpG-paren inom de berörda sekvenserna. Kvantifiering sker i förhållande till ett metylerat referens-DNA. En modifiering av detta protokoll för att öka PCR:s specificitet för framgångsrikt bisulfitkonverterat DNA (ConLight-MSP) använder en extra sond för bisulfit-unkonverterat DNA för att kvantifiera denna ospecifika amplifiering.

En annan metodik som använder MSP-förstärkt DNA analyserar produkterna med hjälp av smältkurvanalys (Mc-MSP). Denna metod amplifierar bisulfitkonverterat DNA med både metylatspecifika och icke-metylatspecifika primers och bestämmer det kvantitativa förhållandet mellan de två produkterna genom att jämföra de differentiella toppar som genereras i en smältkurvanalys. En högupplöst smältningsanalysmetod som använder både kvantitativ PCR och smältningsanalys har introducerats, särskilt för känslig detektion av metylering på låg nivå

Microarray-baserade metoderEdit

Microarray-baserade metoder är en logisk förlängning av de tekniker som finns tillgängliga för att analysera bisulfitbehandlat DNA för att möjliggöra en genomomfattande analys av metylering. Oligonukleotidmikroarrayer utformas med hjälp av par av oligonukleotidhybridiseringsprober som är inriktade på CpG-platser av intresse. Den ena är komplementär till den oförändrade metylerade sekvensen och den andra är komplementär till den C till U-konverterade ometylerade sekvensen. Proberna är också bisulfitspecifika för att förhindra att de binder sig till DNA som inte har omvandlats fullständigt av bisulfit. Illumina Methylation Assay är en sådan test som tillämpar bisulfitsekvenseringstekniken på mikroarraynivå för att generera metyleringsdata över hela genomet.