Brainbow
Brainbow-tekniken bygger på Cre-Lox-rekombination, där proteinet Cre-rekombinas driver inversion eller excision av DNA mellan loxP-platser. Den ursprungliga Brainbow-metoden omfattar både Brainbow-1 och Brainbow-2, som utnyttjar olika former av cre/lox-rekombination. Brainbow-3, en modifierad version av Brainbow-1, utvecklades 2013. För alla Brainbow-subtyper är uttrycket av ett visst XFP en stokastisk, eller slumpmässig, händelse.
Brainbow-1 använder DNA-konstruktioner med olika fluorescerande proteingener (XFP) som separeras av muterade och kanoniska former av loxP. Detta skapar en uppsättning ömsesidigt uteslutande excisionsmöjligheter, eftersom cre-medierad rekombination endast sker mellan identiska loxP-platser. Efter att rekombination skett uttrycks det fluorescerande protein som är kvar direkt efter promotorn unikt. Således kan en konstruktion med fyra XFP:er separerade av tre olika loxP-platser, tre excisionshändelser och den ursprungliga konstruktionen producera fyra olika fluorescerande proteiner.
Brainbow-2 använder Cre excision och inversion för att möjliggöra flera uttrycksmöjligheter i en given konstruktion. I ett DNA-segment med två motsatt orienterade XFP:er inducerar Cre en slumpmässig inversionshändelse som lämnar ett fluorescerande protein i rätt orientering för uttryck. Om två av dessa inverterbara sekvenser är i linje med varandra är tre olika inversionshändelser möjliga. När excisionshändelser också beaktas kommer ett av fyra fluorescerande proteiner att uttryckas för en given kombination av Cre-excisioner och inversioner.
Brainbow-3 behåller Brainbow-1:s loxP-format, men ersätter RFP-, YFP- och CFP-gener med mOrange2, EGFP och mKate2. mO2, EGFP och mK2 valdes både för att deras fluorescerande excitations- och emissionsspektrum överlappar minimalt och för att de har minimal sekvenshomologi, vilket gör det möjligt att utforma selektiva antikroppar som kan användas för att detektera dem i immunohistokemiska protokoll. Brainbow-3 tar också upp frågan om ojämn fyllning av neuroner med XFP:er genom att använda farnesylerade derivat av XFP:erna, som är mer jämnt fördelade till neuronala membran.
Brainbow implementeras in vivo genom att korsa två stammar av transgena organismer: en som uttrycker Cre-proteinet och en annan som har transfekterats med flera versioner av en loxP/XFP-konstruktion. Genom att använda flera kopior av transgenen kan XFP:erna kombineras på ett sätt som kan ge en av cirka 100 olika färger. Således märks varje neuron med en annan nyans baserat på dess givna kombinatoriska och stokastiska uttryck av fluorescerande proteiner.
För att belysa differentiella XFP-uttrycksmönster i en synlig form avbildas hjärnskivor med konfokalmikroskopi. När varje fluorofor utsätts för en foton med sin särskilda excitationsvåglängd avger den en signal som samlas in i en röd, grön eller blå kanal, och den resulterande ljuskombinationen analyseras med en programvara för dataanalys. Överlagring av differentiellt färgade neuroner gör det möjligt att visuellt lösa upp komplicerade neurala kretsar.
Brainbow har hittills främst testats på möss, men den grundläggande tekniken som beskrivs ovan har också modifierats för användning i nyare studier sedan den ursprungliga metoden introducerades 2007.
MiceEdit
Mushjärnan har 75 000 000 neuroner och liknar mer en mänsklig hjärna än drosophila och andra vanliga organismer som används för att modellera denna teknik, såsom C. elegans. Möss var de första organismerna där Brainbow-metoden för neuroimaging framgångsrikt användes. Livet et al. (2007) utvecklade två versioner av Brainbow-möss med Brainbow-1 och Brainbow-2, som beskrivs ovan. När man använder dessa metoder för att skapa en fullständig karta och spåra axonerna i en musmuskel hos en mus är det nödvändigt att samla in tiotusentals bilder och sammanställa dem i staplar för att skapa en fullständig schematisk bild. Det är sedan möjligt att spåra varje motoraxon och dess synaptiska kontakter för att konstruera en komplett connectom av muskeln.
Fler exempel på neuroner som undersökts med hjälp av Brainbow-tekniken i transgena möss finns i den motoriska nerv som innerverar öronmusklerna, axonbanor i hjärnstammen och hippocampus dentata gyrus.
DrosophilaEdit
Drosophilahjärnans komplexitet, som består av cirka 100 000 neuroner, gör den till en utmärkt kandidat för genomförande av neurofysiologiska och neurovetenskapliga tekniker som Brainbow. Stefanie Hampel et al. (2011) kombinerade Brainbow tillsammans med genetiska målinriktningsverktyg för att identifiera enskilda neuroner i Drosophilahjärnan och olika neuronala linjer. Ett av de genetiska målinriktningsverktygen var ett binärt GAL4/UAS-uttryckssystem som kontrollerar uttrycket av UAS-Brainbow och riktar uttrycket till små grupper av neuroner. Genom att använda ”Flip Out”-metoder ökade den cellulära upplösningen av reporterkonstruktionen. Uttrycket av fluorescerande proteiner, liksom med den ursprungliga Brainbow, var beroende av Cre-rekombination som motsvarar matchade loxplatser. Hampel et al. (2011) utvecklade också sin egen variant av Brainbow (dBrainbow), baserad på antikroppsmärkning av epitoper snarare än endogen fluorescens. Två kopior av deras konstruktion ger sex ljusa, separerbara färger. Detta, tillsammans med förenklingar i färgtilldelningen, gjorde det möjligt för dem att observera varje neurons banor över långa avstånd. De spårade särskilt motoriska neuroner från antennloben till neuromuskulära korsningar, vilket gjorde det möjligt för dem att identifiera de specifika muskelmålen för enskilda neuroner.
I slutändan ger den här tekniken möjlighet att effektivt kartlägga det neuronala kretsloppet i Drosophila, så att forskarna kan ta reda på mer information om hjärnans struktur hos detta ryggradslösa djur och hur den är relaterad till det efterföljande beteendet.