Brist på AP-endonukleas EXO-3 orsakar utvecklingsfördröjning och onormal vulvial organogenes, Pvl, genom DNA-glykosylas-initierad kontrollpunktsaktivering i Caenorhabditis elegans

Uttrycksnivån för AP-endonukleaser ökar efter L4-stadiet

Efter kläckningen har C. elegans utvecklas till vuxna genom fyra larvstadier (L1-L4), vart och ett avbrutet av en skiktning av kutikulan. Vuxna stadier delas fortfarande in i två stadier: det unga vuxenstadiet och det gravida vuxenstadiet. För att få en inblick i AP-endonukleasernas roll efter embryogenesen mätte vi den tidsmässiga förändringen i mRNA-uttrycksnivån för exo-3 eller apn-1. Vid 0, 24 och 48 timmar, när de flesta N2-maskar befinner sig i äggstadiet, L1-stadiet respektive L4-stadiet, hittades ingen skillnad i mRNA-uttrycksnivå för både exo-3 och apn-1 (fig. 1a,b). Vid 60 timmar, när de flesta N2-maskar befinner sig i det unga vuxna stadiet, var exo-3- och apn-1-uttrycksnivåerna ungefär 13 gånger respektive 2,3 gånger högre än vid 0 timmar (fig. 1a,b). Uttrycksnivån vid 72 timmar, när de flesta N2-maskarna befinner sig i det gravida vuxna stadiet, var densamma som vid 60 timmar (fig. 1a,b). Dessa resultat tyder på att AP-endonukleaserna behövs efter embryogenesen, särskilt efter L4-stadiet.

De exo-3 mutanterna uppvisar utvecklingsfördröjning

För att klargöra AP-endonukleasernas bidrag till maskens utveckling från L4- till vuxenstadiet inkuberades maskar som var bristfälliga på en eller båda AP-endonukleaserna (EXO-3 och APN-1) under normala uppfödningsförhållanden under 3 dagar från det befruktade äggstadiet (fig. 1c). Utvecklingsstadier bland L4-, ung vuxen- och gravid vuxenstadierna skiljdes åt genom tillståndet för vulvamorfologin och äggbrödning (Fig. 1d,f). Även om alla N2-maskar utvecklades till gravida vuxna var endast 14 % av exo-3-mutanterna i det gravida vuxna stadiet, 85 % i det unga vuxna stadiet och 1 % i larvstadiet (fig. 1g), vilket tyder på att EXO-3-brist orsakar att utvecklingen upphör eller att utvecklingen försenas. Däremot blev alla apn-1-mutanter gravida vuxna, och apn-1;exo-3-mutanter befann sig i nästan samma utvecklingsstadier som exo-3-mutanter (fig. 1g). Tolv timmar senare nådde alla exo-3- och apn-1;exo-3-mutanter det gravida vuxna stadiet (data visas inte), vilket tyder på att EXO-3-brist inte orsakar ett avbrott i utvecklingen i det unga vuxna stadiet, utan endast en utvecklingsfördröjning. För att exakt undersöka hur lång fördröjningen hos exo-3-mutanterna var, mätte vi tiden till gravid vuxen för varje mask varannan timme och beräknade skillnaden i genomsnittstid mellan N2 (N = 8) och exo-3-mutanterna (N = 16). Skillnaden var 6 timmar.

Utvecklingsfördröjningen hos exo-3-mutanterna är beroende av DNA-glykosylaset NTH-1

Det är rimligt att dra slutsatsen att utvecklingsfördröjningsfenotypen hos exo-3-mutanterna orsakas av ackumulationen av AP-platser eller 3′- blockerad SSB i DNA eftersom dessa är substrat för EXO-315. Dessa strukturer i DNA kan genereras av DNA-glykosylaser. Av de två DNA-glykosylaser som finns bevarade i C. elegans genererar UNG-1 AP-platser genom monofunktionell DNA-glykosylasaktivitet på uracil i DNA, och NTH-1 producerar 3′-blockerade SSB genom bifunktionell DNA-glykosylasaktivitet på oxidativa pyrimidinlesioner i DNA. Därför undersökte vi om fördröjningen i exo-3-mutanterna är beroende av UNG-1 och NTH-1. Tre dagar efter att ha utvecklats från ägg var 9 % av ung-1;exo-3-mutanterna i det gravida vuxenstadiet, 86 % i det unga vuxenstadiet och 5 % i larvstadiet, och dessa proportioner var nästan desamma som de som uppvisades av exo-3-mutanterna (11 % i det gravida vuxenstadiet, 85 % i det unga vuxenstadiet och 4 % i larvstadiet) (fig. 2), vilket tyder på att fördröjningen är oberoende av UNG-1. Däremot befann sig 94 % av nth-1;exo-3-mutanterna i det gravida vuxenstadiet och 6 % i det unga vuxenstadiet. Nth-1;ung-1;exo-3 mutanterna uppvisade liknande resultat (Fig. 2), vilket tyder på att fördröjningen är beroende av NTH-1.

Utvecklingsfördröjningen hos exo-3-mutanterna förstärks av MMS och NaHSO3

För att klargöra om AP-platsgenererande ämnen kan orsaka utvecklingsfördröjning utförde vi en utvecklingsanalys med hjälp av MMS och natriumbisulfit (NaHSO3) (fig. 3a). MMS är känt för att indirekt skapa AP-platser20,21 och har visat sig inducera DNA-skador i C. elegans genom22. 3,5 dagar efter det att äggen lagts på plattor som innehöll 0,94 mM MMS befann sig 97 % av N2 i det gravida vuxenstadiet och 3 % i larvstadiet, medan 61 % av exo-3-mutanterna befann sig i det gravida vuxenstadiet, 34 % i det unga vuxenstadiet och 5 % i larvstadiet (fig. 3b), vilket tyder på att de MMS-inducerade AP-platserna orsakar en ytterligare försening av utvecklingen hos exo-3-mutanterna än hos N2. Å andra sidan befann sig 93 % av apn-1-mutanterna i det gravida vuxenstadiet, 6 % i det unga vuxenstadiet och 1 % i larvstadiet, vilket liknar resultaten för N2 (fig. 3b). NaHSO3 skadar DNA huvudsakligen genom deaminering av cytosin till uracil23. Fyra dagar efter utvecklingen från äggstadiet utvecklades alla exo-3-mutanter som inte behandlades med NaHSO3 till gravida vuxna, men 33 % av dem som behandlades med 10 mM NaHSO3 befann sig i det gravida vuxna stadiet, 12 % befann sig i det unga vuxna stadiet och 55 % befann sig i larvstadiet (fig. 3c), vilket tyder på att NaHSO3 inducerade en utvecklingsförsening hos exo-3-mutanterna. Denna fördröjning lindrades i mutanterna ung-1;exo-3, eftersom 79 % av dem som behandlades med 10 mM NaHSO3 befann sig i det gravida vuxenstadiet, 14 % i det unga vuxenstadiet och 7 % i larvstadiet (fig. 3c), vilket tyder på att den NaHSO3-inducerade utvecklingsfördröjningen berodde på UNG-1-aktivitet. Sammantaget kan AP-platser orsaka utvecklingsfördröjning liksom 3′-blockad SSB som genereras av NTH-1.

Utvecklingsfördröjningen hos exo-3-mutanter induceras av CHK-2

Nästan antog vi att den DNA-glykosylasinitierade utvecklingsfördröjningen hos exo-3-mutanter berodde på aktivering av DNA-skadekontrollpunkten som drivs av klyvningsprodukter som produceras av DNA-glykosylaser. Gener för DNA-skadekontrollpunkt, såsom chk-2 och clk-2, har beskrivits i C. elegans24. För att testa vår hypotes genomfördes utvecklingsanalysen under chk-2 (RNAi) eller clk-2 (RNAi) förhållanden (fig. 4a). Även om 14 % av exo-3;kontroll (RNAi)-maskarna befann sig i det gravida vuxna stadiet och 84 % i det unga vuxna stadiet, och exo-3;clk-2 (RNAi)-maskarna uppvisade liknande proportioner (18 % i det gravida vuxna stadiet och 82 % i det unga vuxna stadiet), befann sig 93 % av exo-3;chk-2 (RNAi)-maskarna i det gravida vuxna stadiet (fig. 4b). Således räddade knockdown av chk-2 utvecklingsfördröjningen hos exo-3-mutanter, vilket tyder på att CHK-2 inducerar utvecklingsfördröjningen hos exo-3-mutanter.

EXO-3 förhindrar dut-1 (RNAi)-inducerad Pvl-bildning

DUT-1 är ett deoxyuridin-trifosfat-nukleotidohydrolas (dUTPas), som hydrolyserar dUTP till dUMP. Därför leder dut-1 (RNAi) till ökad dUTP i nukleotidpoolen, som inkorporeras i DNA genom DNA-replikation i stället för dTTP, vilket orsakar ackumulering av uracil i DNA25,26. Det har rapporterats att dut-1 (RNAi) inducerar onormal vulvial organogenes, Pvl, i vild typ N2 maskar, och att den dut-1 (RNAi)-inducerade Pvl är beroende av UNG-127. Vi spekulerade i att EXO-3-brist orsakar en ökad förekomst av dut-1 (RNAi)-inducerad Pvl eftersom EXO-3 behövs för att reparera AP-platser efter UNG-1:s klyvning av uracil i DNA. För att bekräfta detta observerades dut-1 (RNAi)-inducerad Pvl-bildning i AP-endonukleasbristande mutanter (fig. 5a-c). Av de överlevande vuxna 4 dagar efter utveckling från ägg var 52 % exo-3-mutanter med dut-1 (RNAi)-inducerad Pvl och 13 % var N2-maskar med Pvl (Fig. 5d), vilket tyder på att EXO-3-brist orsakar en ökning av dut-1 (RNAi)-inducerad Pvl. Å andra sidan hade 15 % av apn-1-mutanterna Pvl, vilket liknar andelen N2- maskar med Pvl (fig. 5d). Andelen apn-1;exo-3-mutanter och exo-3-mutanter var likartad, 52 % hade Pvl (Fig. 5d).

Ökningen av dut-1 (RNAi)-inducerad Pvl i exo-3 mutanterna är beroende av UNG-1 oavsett NTH-1

För att undersöka om ökningen av dut-1 (RNAi)-inducerad Pvl i exo-3 mutanterna skedde genom UNG-1 aktivitet undersökte vi fenotypens beroende av UNG-1. Procentandelen ung-1;exo-3-mutanter med Pvl var 2 %, vilket var detsamma som för ung-1-mutanter med Pvl (1 %) (fig. 6a), vilket tyder på att ökningen av Pvl i exo-3-mutanter endast beror på UNG-1-uttryck.

Nästan undersökte vi om de klyvningsprodukter som produceras av UNG-1 behövs för att inducera Pvl, dvs. om AP-platser omvandlas till 3′-blockerade SSB via AP-lyasaktiviteten hos NTH-1. Procentandelen exo-3-mutanter med Pvl var jämförbar med den för nth-1;exo-3-mutanter (fig. 7b), vilket tyder på att NTH-1 inte är nödvändig för dut-1 (RNAi)-inducerad Pvl.

Ökningen av dut-1 (RNAi)-inducerad Pvl i exo-3-mutanter drivs av CHK-2

Vi antog att den UNG-1-beroende ökningen av dut-1 (RNAi)-inducerad Pvl i exo-3-mutanter kan ske via DNA-kontrollpunktsaktivering som drivs av klyvningsprodukter som produceras av UNG-1, utöver utvecklingsförsening. Det har också rapporterats att dut-1 (RNAi)-inducerad Pvl orsakas av kontrollpunktskinaset CLK-227. Därför undersökte vi om ökningen av dut-1 (RNAi)-inducerad Pvl i exo-3-mutanter var beroende av CHK-2 och CLK-2. Även om 49 % av exo-3;kontroll (RNAi)-maskarna hade dut-1 (RNAi)-inducerad Pvl hade endast 10 % av exo-3;chk-2 (RNAi)-maskarna det (fig. 6b). Å andra sidan var andelen exo-3;clk-2 (RNAi)-maskar med Pvl nästan lika stor (44 %) som andelen exo-3;kontroll (RNAi)-maskar. Därför räddade knockdown av chk-2 ökningen av dut-1 (RNAi)-inducerad Pvl hos exo-3-mutanter, vilket observerades för utvecklingsfördröjning. Dessa resultat tyder på att ökningen av dut-1 (RNAi)-inducerad Pvl i exo-3-mutanter sker via CHK-2-uttryck.

Oxidativa DNA-skadliga ämnen ökade andelen Pvl i exo-3-mutanter endast i kombination med dut-1 (RNAi)

För att undersöka andra DNA-skadliga ämnen som orsakar en ökning av Pvl i exo-3-mutanter utvärderade vi om Pvl-bildningen förstärks av oxidativa DNA-skadliga ämnen som ndx-1 (RNAi), ndx-2 (RNAi) och metylviologen (MV). NDX-1 och NDX-2 hydrolyserar 8-oxo-dGDP till 8-oxo-dGMP24,28. Följaktligen leder ndx-1 (RNAi) och ndx-2 (RNAi) till en ökning av 8-oxo-dGDP i nukleotidpoolen. Närvaron av 8-oxo-dGDP minskar NDX-4:s 8-oxo-dGTPaseaktivitet, vilket leder till att 8-oxo-dGTP ackumuleras i poolen24. 8-oxo-dGTP inkorporeras i DNA under DNA-replikation, vilket leder till att 8-oxoG ackumuleras i DNA24,28. MV genererar superoxidradikaler som sedan orsakar oxidativa skador i DNA29. Enkel behandling med ndx-1 (RNAi), ndx-2 (RNAi) eller MV hade dock ingen effekt på förekomsten av Pvl hos exo-3-mutanter. (data visas inte). Därefter undersökte vi om varje oxidativt DNA-skadligt medel i kombination med dut-1 (RNAi)-behandling ytterligare förstärkte ökningen av Pvl i exo-3-mutanterna (fig. 7a). Varje testad behandling ökade ökningen av dut-1 (RNAi)-inducerad Pvl i exo-3-mutanterna med cirka 10 % (fig. 7b), vilket tyder på att oxidativa lesioner i DNA också kan orsaka en ökning av Pvl.

I in vitro-experiment visade sig NTH-1 ha en svag DNA-glykosylasaktivitet mot 8-oxoG i DNA, utöver sin mycket högre aktivitet mot oxidativa pyrimidinlesioner30. Vi misstänker därför att den högre ökningen av dut-1 (RNAi)-inducerad Pvl av de ytterligare oxidativa agenterna beror på aktiviteten hos NTH-1. Även om vi bekräftade fenotypens beroende av NTH-1, förändrade NTH-1-brist inte andelen maskar som uppvisade Pvl (Fig. 7b).