Cellulära system för epitelinvagination

Epitelinvagination som en multicellulär mekanism

I djurens utveckling, från de allra tidigaste blastocyst- eller blastodermstadierna ända fram till de allra sista stadierna av organogenesen, organiserar sig embryona i epitelskikt. Epitel är brett definierat. Det kan vara ett ark av kuboidala, kolonnformade eller skivepitelceller (tillplattade), eller innehålla en blandning av cellformer av varierande höjd för att ge sken av flera lager (pseudostratifiering), eller till och med bestå av något av ovanstående i flera lager och vara verkligt stratifierat. I alla stadier och för alla epitelialtyper är dock utarbetandet av anatomin beroende av epiteliernas självböjande förmåga att forma veck, kammar, gropar och rör. Som en byggsten i morfogenesen skapar epitelialböjning nästan alla organ, från det primitiva tarmröret som bildar den primära kroppsaxeln under gastrulation till de finaste porerna som är hårsäckarna på huden. Epitelböjning är självklart en flercellig process där flera sammankopplade celler samordnar sitt beteende för att ändra vävnadens form. Med andra ord är epitelböjning en framväxande egenskap hos ett system av celler vars handlingar inte kan beskrivas på lägre nivåer: gennätverk och klassisk (till stor del subcellulär) cellbiologi kan inte fullt ut fånga epitelböjningsprocessen. Trots att det är en mycket utbredd process är våra detaljerade beskrivningar och vår mekanistiska förståelse av epitelböjning begränsad till ganska få fall och typer.

Aspekter av epitelböjning som leder till både invagination (vikning inåt) och evagination (vikning utåt) har granskats tidigare . Denna genomgång fokuserar på böjning som leder till invagination av epitelet, med utgångspunkt i cellulära beteenden. Vi börjar vår sammanfattning från den ganska väl beskrivna apikala förträngningen, via apikal kabeldriven buckling, cellförkortning genom andra mekanismer och basal kilning, till apikal/basal bunkring och vertikal teleskopering till den relativt nya och föga karakteriserade suprabasala interkalationen. Denna ordning återspeglar epitelkomplexitetens hierarki från ett monolager till pseudostratifierad och slutligen stratifierad struktur. Den återspeglar också en hierarki av komplexitet i de inblandade cellulära processerna.

Apisk konstriktion

Apisk konstriktion definieras som en mekanism där epitelceller genomgår apikal krympning samtidigt som de behåller en mer eller mindre konstant volym . Flera bra översikter har nyligen publicerats om apikal konstriktion och läsaren hänvisas till dessa för en omfattande analys. Här kommer vi att beskriva några framträdande drag.

Förra tvådimensionella fysiska modeller gjorda med stålstavar och gummislangar visade att differentiell spänning mellan epitelcellernas apikala och basala ytor skulle leda till böjda epitelceller, förutsatt att cellvolym och höjd bibehölls . Dessutom visade tidiga observationer av epitelböjning i en rad olika organ och organismer att cellerna i den böjda vävnaden som är kilformade har ett ytligt gelskikt på den konkava sidan av krökningen . Detta sammandragande gelskikt upptäcktes senare bestå av aktinfilament , som tillsammans med motorproteinet myosin II agerar för att böja epitelet (figur 1). Apikal aktomyosinberikning och kontraktilitet har blivit definierande kännetecken för apikal förträngning . Regleringen av aktomyosincytoskelettet är komplex, men bland de många reglerande faktorerna främjas rekryteringen av detta kontraktila maskineri framför allt av Rock and Shroom . Ytterligare studier har visat att även om Shroom är både nödvändig och tillräcklig för den apikala fördelningen av det kontraktila nätverket av aktomyosin, fungerar andra molekyler mycket ofta för att placera olika komponenter av maskineriet på rätt plats. Till exempel krävs Rho GTPas och p120 catenin för att lokalisera myosin II apikalt i cellen. BMP, som verkar uppströms Rock vid invagination av kycklingens otiska placode (neuroepitelial), tycks krävas för apikal lokalisering av aktin oberoende av en roll i celltypsspecifikation .

Live imaging av invaginerande vävnader har gett en alltmer sofistikerad bild av hur den apikala förträngningen äger rum. Man antog till exempel länge att cellerna genomgår apikal konstriktion genom en handväskeliknande sammandragning av aktinfibrer runt den apikala ytans omkrets. Livebilder vid gastrulation i Drosophila avslöjade att det i stället för omgivande fibrer är ett apikalt nät av diametrala fibrer som spelar den dominerande rollen vid sammandragningen av den apikala ytan (även om det för närvarande inte finns några motsvarande bevis hos ryggradsdjur). Kontraktionsprocessen är också mindre enkel än vad man tidigare trodde. I stället för en jämn och synkron sammandragning har det nyligen visats att enskilda celler genomgår tillfälliga pulser av ratchetliknande sammandragning asynkront med sina grannar . När sammandragningarna har inletts stabiliseras det sammandragna tillståndet mellan pulserna, så att nettoresultatet blir en minskning av arean av cellens apikala ände . Spänningen från dessa enskilda sammandragningar överförs troligen apikobasalt genom cytoplasmatisk förskjutning, åtminstone så som man ser det i Drosophila mesoderm ; samtidigt överförs spänningen i vävnadsplanet via aktomyosinnätverket, som är samlat i enskilda celler och förbundet intercellulärt genom adherens-junkter , för att böja hela vävnaden.

Basal relaxation

Om cellvolymen ska bevaras måste apikal konstriktion åtföljas av antingen basal expansion eller höjdökning (eller båda). Höjdökning har observerats i trakeal- och spottkörtelplacode före invagination hos flugembryon , och det som vi här kallar ”basal relaxation”, där det basala aktin- eller myosinnätverket aktivt bryts ned (figur 2), har rapporterats vara involverat i invaginationen av kycklingens otiska placode och i Drosophilas bildande av ventralfåran i gastrulation . I kycklingens otiska vesikel föregår basal relaxation den apikala förträngningen och är beroende av basalt presenterade FGF-signaler och verkar därför inte nödvändigtvis vara kopplad till apikala händelser, inklusive den efterföljande förträngningen. I Drosophila gastrulation följer emellertid en minskning av den basala myosinintensiteten och i sin tur den basala styvheten med den apikala förträngningen och expanderar den basala ytan, en fas som med stor sannolikhet inleder övergången från cellkolumnisering till cellförkortning och invagination . I en nyligen publicerad artikel av Lomakin et al. antyds att ackumulering av aktomyosin i en del av en cell under migration orsakar utarmning i en annan del av cellen. Detta skulle kunna vara ett sätt på vilket basal relaxation skulle kunna utlösa eller vara nödvändig för efterföljande apikal konstriktion under invagination. Opublicerad datormodellering av epitelveckning i vingskivepitel har föreslagit att basal relaxation i det sammanhanget faktiskt kan vara mekaniskt viktigare än apikal konstriktion (Guillaume Salbreux 2016, personlig kommunikation).

Apisk kabeldriven buckling

I ett antal sammanhang koordineras flera cellers kontraktionskraft via aktomyosin-”kablar” . Aktomyosinkablar är supracellulära strukturer som finns i enskilda celler och som ligger i linje mellan intilliggande celler och troligen är anslutna via specifika korsningar, även om det fortfarande är okänt hur de är anslutna på molekylär nivå. Dessa supracellulära strukturer har observerats inte bara under invagination , utan även i andra processer , för att samordna sammandragning.

Ett exempel på invagination som drivs av aktomyosinkablar är kycklingens stängning av neuralröret, där mediolateralt orienterade myosinkablar löper över flera cellängder, vilket främjar cellinterkalation mediolateralt för att både förlänga neuralröret (konvergerande förlängning) och böja neuroepitelet mediolateralt . Denna planar-polariserade sammandragning av aktomyosinkablar främjas av uppströms PCP-signalering och även polariserad distribution av Celsr1 och ROCK .

Epitelet i den utvecklande Drosophila använder sig av konstriktion i kombination med cellulär omorganisering och cellavrundning för att åstadkomma invagination av flera luftrörsgropar som senare kommer att bilda luftrörsnätverket genom vilket syre diffunderar till flugans vävnader . Innan invaginationen inleds går cellerna i placode in i mitotisk vila . Korta omkretsmässigt riktade bågar av aktomyosinkablar bildas tillfälligt när grupper av ett fåtal celler interkalerar (likaså omkretsmässigt) runt den bildande gropen . Detta följs av en stark apikal förträngning av cellerna i plakodens absoluta centrum och mindre hårt förträngda apikaler i de omedelbart omgivande cellerna, vilket bildar en grund trakeal grop . De invaginerande cellerna i centrum genomgår mitotisk cellavrundning som påskyndar processen genom att orsaka en snabb minskning av cellhöjden, vilket avslutar invagineringen i en snabb fas . Det visades att det är avrundningen av de mitotiska cellerna och inte celldelningen som driver den snabba fasen av invaginationen. Man kan spekulera i att rundade celler gör epitelet strukturellt svagare. De har ett mindre styvt kortikalt cytoskelett, en mindre kolonnform (vilket gör epitelet tunnare) och möjligen svagare fästen till sina grannar. De skulle därför kunna fungera som bucklingspunkter där epitelet böjer sig med mindre motstånd mot den spänning som upprätthålls av de cirkumferentiella kablarna i de omgivande icke-delande cellerna (figur 3).

Cellförkortning

Fällning av Drosophilas benepitel för att göra skarvar mellan segmenten representerar en annan variant av cellulära förträngningar, som i det här fallet är en krympning av hela celler i kombination med apoptos . Under morfogenesen av Drosophilas benepitel är apoptos nödvändig, men inte tillräcklig, för att apikal förträngning ska inträffa , och i en relativt ny rapport beskrivs en apikobasal aktomyosin-”kabel” som löper vertikalt genom cellens centrum vid den vikande placode (figur 4) och som ser ut som om den skulle kunna utöva en vertikal dragkraft nedåt på den apikala ytan av de närliggande cellerna . Dessa vertikala ”kablar” får inte förväxlas med de plana bågar av aktomyosinkablar som nämns i punkt 4 och är helt nya encelliga strukturer vars struktur och dynamik ännu inte har undersökts. Liksom för mitotiskt rundande celler skulle en apoptotisk cell förmodligen vara strukturellt svagare än sina icke-apoptotiska grannar och skulle därför kunna fungera som en bucklingspunkt. Den apikobasala ”kabeln” antyder dock en mer aktiv mekanism, liksom det faktum att den apoptotiska cellen inte stöts ut. Det verkar troligt att aktomyosinkabeln har en aktiv roll att spela vid apoptosdriven buckling.

Cellförkortning har också observerats i andra fall av epitelinvagination. Vid gastrulation av ascidier visade Sherrard et al. att apikal förträngning av de endodermala cellerna faktiskt inte driver invaginationsprocessen; snarare leder en basolateral ackumulering av myosin till apikobasal förkortning av cellerna och initierar invaginationen. En annan mekanism är att dorsalveck i det tidiga Drosophila-embryot i början av gastrulationen initieras av en basal förskjutning av adherens-junkterna i de invaginerande cellerna, vilket leder till en felplacering av junkterna i förhållande till granncellerna, vilket bidrar till att driva på vävnadsbucklingen. Även om det har visats att positionerna för adherens-junkterna regleras av polaritetsproteinerna Par1 och Bazooka återstår det att undersöka den fysiska mekanismen.

Basal kilning

Kantformade celler i en invaginerande vävnad är en oundviklig konsekvens av vävnadsgeometrin och indikerar inte nödvändigtvis en apikal inskränkning. Under neuralrörsutvecklingen kommer en process som kallas basal kilning in i bilden där kilning sker som är helt skild från apikal konstriktion. Vid mittlinjen av en stor del av det bildande neuralröret hos amnioter böjer sig epitelet skarpt för att bilda vad som kallas den mediala gångjärnspunkten (MHP) . Cellerna i dessa ledpositioner är nästan alla kilformade, medan deras grannar har en blandning av former, mestadels spindelformade, vilket återspeglar epitelets pseudostratifierade karaktär (figur 5). Viktigt är att cellerna är mycket tätt packade i epitelplanet och är så smala att varje cell böljar runt sin kärna. Gångjärnscellernas kilform är, åtminstone till stor del, ett resultat av basalt placerade kärnor. Detta verkar vara relaterat till interkinetisk kärnmigration, som är kärnans apikobasala rörelse när cellcykeln fortskrider: cellerna delar sig apikalt och när de befinner sig i S-fasen befinner sig kärnan basalt, och i enlighet med detta tillbringar cellerna vid gångjärnet längre tid i S-fasen. Celldelningscykeln har på samma sätt involverats i den böjda morfogenesen av den optiska kupan . Huruvida cellcykelkontroll är den nödvändiga eller enda drivkraften bakom apikobasal kärnposition förblir dock en öppen fråga . Viktigt är att basal kilning experimentellt skiljdes från apikal förträngning genom att konstatera att inhibering av aktinpolymerisering, samtidigt som den fick större delen av neuralröret att slå upp och apikala ytor att expandera över hela neuralplattan , misslyckades med att avskaffa böjning vid den mediala gångjärnspunkten . Detta visar också att böjningen av medianhänget är inneboende, eftersom relaxationen av det flankerande epitelet frikopplar medianhänget från extrinsiska krafter och att basal kilning sker på ett annat sätt än apikal konstriktion.

Vertikal teleskopering och apikal/basal bunkring

Intressant nog finns det i vissa anteroposteriora regioner av neuralröret också dorsolaterala gångjärnspunkter som varken involverar basal kileffekt eller (cytokalasin-känslig) apikal konstriktion . Även om extrinsisk tryckkraft från den flankerande ektodermen har föreslagits som en böjningsmekanism har nyare bevis argumenterat mot detta och föreslagit att differentiell cellpackning som genereras av cellproliferation och translokation i musens neuralrör leder till att strukturen viks.

I samband med detta beskrev Jacobson, Oster et al. 1986 i Xenopus-grodor ett cellulärt beteende för höjning av neuralvecket (neurulationens sidoöppning) som de kallade ”tractoring”. Termen ”tractoring” togs upp och användes igen i samband med epitelböjning vid gastrulation av sjöborrar i ytterligare två artiklar . Vad dessa tre artiklar tar upp är värt att överväga i detalj (se nästa stycke). Tyvärr användes termen ”tractoring” också i samma artikel från 1986 för att beskriva inte bara cellbeteendena som sådana utan också en spekulativ subcellulär mekanism som skulle kunna driva dem. I denna spekulativa användning av termen ”tractoring” flyter cellkortexet som en larvspår runt cellen för att flytta cellen i förhållande till sina grannar . Det är svårt att föreställa sig cortical tractoring i epitelceller med täta korsningar, vilket skulle förhindra cortical rörelse, och idén har aldrig följts upp (även om embryonala epitelceller, särskilt i däggdjursembryon, ofta saknar täta korsningar och kan ha en mer labil vidhäftning). En nyligen publicerad artikel har återupplivat idén om kortikal traktorering för isolerade celler som migrerar i trånga utrymmen . För att undvika förvirring kommer vi att överge termen ”tractoring” helt och hållet (utom inom citationstecken, där dessa författare använde den). Istället erbjuder vi två nya termer – för det är faktiskt två cellbeteenden inblandade – nämligen vertikal teleskopering och basal (eller apikal) bunkring.

En effekt som Jacobsen et al. beskrev som inträffade under böjning av neurala plattor var att cellerna glider vertikalt förbi varandra, på samma sätt som stegen på en stigande rulltrappa gör, för att skapa en lutning eller böjning. Ett annat användbart sätt att beskriva detta är att epitelet sträcker sig nedåt genom vertikal förskjutning, i praktiken skjuvning, mellan dess celler som är organiserade runt invaginationens centrum, ungefär på samma sätt som ett teleskop sträcker sig genom att dess sektioner glider (figur 6a). Vi föreslår ”vertikal teleskopering” som en term för denna process för att fånga inte bara idén om vertikal ”skjuvning” utan också dess koncentriska arrangemang. Det är osannolikt att cellerna verkligen skär sig. Den vertikala cellrörelsen liknar snarare klassisk cellmigration, där cellerna kryper eller rullar över fasta vidhäftningspunkter, och rörelsen sker genom att basala eller apikala utskjutande delar förlängs (figur 6b,c). Vi har vissa preliminära bevis för att vertikal teleskopering förekommer vid morfogenes av tänder och invagination av spottkörtlar (E. Panousopoulou, J.Li och J.B.A. Green 2016, opublicerade uppgifter). Observationerna i musens laterala neuralrör som nämns ovan stämmer överens med denna typ av mekanism, men vertikala skjuvliknande rörelser återstår att observera direkt.

En annan mekanism som har beskrivits med termen ”tractoring” finns i gastrulation hos sjöborrar och består av apikala cellprotrusioner som ”drar” sig själva centripetalt, vilket tvingar cellerna in i centripetalt lutande orienteringar och följaktligen böjs epitelet (figur 6d) . Denna process modelleras tydligast som kontraktila apikala cellförlängningar i en annan artikel som använder termen ”tractoring” , och vi döper här om denna process till ”apical bunching” (figur 6d), där ordet ”bunching” förmedlar idén om att samla ihop (av cellspetsar) genom att pressa utifrån (av angränsande cellers apikala utskjutande delar som förlängs lateralt). Apikal bunching skiljer sig från vertikal teleskopering genom att bunching leder till formförändring utan vertikal förskjutning, medan vertikal teleskopering tvärtom definieras som vertikal skjuvning utan formförändring. Dessa definitioner är dock teoretiska: i praktiken kan lateral krypning av apikala utbuktningar samtidigt både deformera och trycka ner angränsande celler (figur 6d). Apikal bunkring skiljer sig också från apikal konstriktion eftersom kraften vid bunkring är extrinsisk för den deformerade cellen, medan den vid konstriktion är intrinsisk.

Jacobson et al. hade också föreslagit att basala utskjutningar av celler i neuralplattan avancerade lateralt längs basallaminan och nådde in under sina grannar. En effekt av detta tycks vara att dessa celler komprimeras lateralt vid sina baser, vilket driver det neurala vecket att evaginera (vilket skapar en konkav invaginationsliknande böjning i den intilliggande delen av neuralplattan på ett passivt sätt). Detta skulle kunna beskrivas som ”basal bunching” i motsats till apikal bunching, men det finns fortfarande inga tydliga experimentella observationer av detta fenomen för att bekräfta dess existens.

Suprabasal interkalation: böjning av ett flerskiktat epitel

De flesta av ovanstående mekanismer gäller antingen monolager eller pseudostratifierade epitel. Ett kvarstående mysterium är därför hur ett stratifierat epitel, som mycket ofta uppträder i tidig organogenes, t.ex. i tandplacode, hårsäcken och bröstkörteln, böjs till en knopp eller ett rörformigt organprimordium. En nyligen genomförd studie visade att i dessa böjda epitelceller är aktin och fosforylerat myosin inte berikade apikalt i de kilformade basalskiktscellerna, och kärnorna är inte huvudsakligen basalt belägna . Därför tycks varken apikal konstriktion eller basal kilformning vara inblandade i denna process.

Teoretiskt sett har lokalt förhöjd proliferation, och mer specifikt stratifiering, av celler ovanför det basala lagret föreslagits vara tillräcklig för att driva ”nedtillväxt” av ett epitel (figur 7) ; i själva verket visade en undersökning av spindelorientering i kindtanden, en av de största epitelorganplacoderna, att celldelningen i plaoden sker vinkelrätt mot vävnadens plan, vilket skapar de suprabasala cellerna (figur 7b) . På förhand skulle man dock förvänta sig att stratifiering skulle förtjocka ett epitel både uppåt och nedåt, eller till och med bara uppåt om den underliggande (mesenkymala) vävnaden var styv. Experimentellt upptäckte man dessutom i samma arbete att stratifiering i sig inte räcker för att driva invagination och att hämning av proliferation inte hämmar invagination . Med andra ord är ”down growth” en otillräcklig beskrivning av tidig placodeinvagination. I stället visade det sig att suprabasala celler genererar den nödvändiga böjspänningen, vilket avslöjades genom observation av förhöjt aktin och fosfomyosin, cellinterkalationsrörelser och rekyl vid fysisk skärning . Den plana spänning som skapas i suprabasala lager genom plan cellinterkalation visade sig överföras till den basala lamina av basala lagerceller som är förankrade basalt men samtidigt sträcker ut centripetalt orienterade apikala utskjutningar som deltar i interkalationen (figur 7c) . Det basala lagret motstår lateral kompression och måste därför böja sig som svar på den suprabasala sammandragningen. Topologiskt sett tar suprabasala celler i de ektodermala placoderna rollen som apikala aktomyosinkablar, men i mycket större skala.

Slutsats

Som specificerat i §1 har vi här försökt att ge en kort, aktuell sammanfattning av de viktigaste mekanismerna som tros vara inblandade i epitelinvagination. Det är värt att nämna att de olika mekanismer som diskuteras här inte nödvändigtvis utesluter varandra. Till exempel är proliferation ett nödvändigt villkor för suprabasal interkalation i stratifierat epitel, basal relaxation föregår normalt apikal konstriktion, och apikal eller basal bunching kan verka tillsammans med apikal konstriktion eller basal kilning. Hierarkin i de mekanismer som diskuteras representerar också begränsningarna i vår kunskap. Apikal konstriktion antas kanske vara vanlig främst på grund av att den är uppenbar i den tidiga utvecklingen av laboratoriemodellorganismer. De andra mekanismerna är successivt mindre uppskattade, men förtjänar att betraktas på ett mer likvärdigt sätt, eftersom de kan vara vanligare och viktigare i senare utveckling och hos olika arter än vad som hittills har uppskattats. Invagination är bara en typ av epitelböjning. Av utrymmesskäl har vi utelämnat diskussionen om den mest uppenbart besläktade morfogenetiska processen, nämligen evagination, t.ex. genom basal konstriktion, vilket leder till en utåtriktad veckning av vävnad . Vi har också begränsat denna genomgång genom att fokusera på böjning som drivs av inneboende krafter. Med ”inneboende” menar vi krafter som genereras inom själva epitelet (men inte nödvändigtvis bara vid böjningspunkten, vilket exemplifieras av kabeldriven buckling). Förutom de inneboende krafterna kan böjning av rör som tarmen eller hjärtat drivas av krafter utanför epitelet, t.ex. motståndskrafter som genereras i fäst eller omslutande oelastisk vävnad när epitelet självt växer .

Istället för att t.ex. fokusera på biomekaniska aspekter av epitelböjning eller göra en omfattande genomgång av epitelmorfogenesen som helhet har vi gett en skiss över en mängd olika cellsystem som genom samordnade ensemblebeteenden genererar den anatomi som krävs. För några av dessa finns det en viss förståelse för molekylära mekanismer, men för de flesta är kopplingen mellan subcellulära molekylära processer och supracellulära resultat på vävnadsnivå fortfarande grov. Det står dock klart att det är upplysande att betrakta mekanismen på en supracellulär eller flercellig skala. Genom att på detta sätt betrakta epiteliella invaginationer som system av celler kan den fantastiska mångfalden av utvecklingshändelser reduceras till ett litet antal lättfattliga motiv. Att identifiera och karakterisera dessa motiv (även med variationer) blir därmed en genomförbar agenda för både experimentella och teoretiska framsteg.

Författarnas bidrag

Alla författare har bidragit till utformning, utkast, figurer och redigering av manuskriptet.

Kompletterande intressen

Vi har inga konkurrerande intressen.

Finansiering

Det här arbetet finansierades av BBSRC grant nr. BB/L002965/1 till J.B.A.G.

Fotnoter

Ett bidrag av 13 till ett temanummer ”Systems morphodynamics: understanding the development of tissue hardware”.