Cytotoxiska och genotoxiska effekter av acefat på mänsklig sperma

Abstract

En omfattande användning av organiska fosforbekämpningsmedel kan förändra spermakvaliteten och spermiernas DNA i olika stadier av spermatogenesen. Acefat är ett mycket giftigt och extensivt använt OP och därför syftade vi till att utvärdera effekterna av acefat på human spermakvalitet och spermiernas DNA-integritet. Sperma som samlats in från friska män exponerades för 0, 50, 100 och 200 μg/ml acefat och inkuberades i 1 timme, 2 timmar och 3 timmar. Därefter undersöktes spermiernas motilitet, vitalitet, plasmamembranets funktionella integritet, spermiekapacitering och DNA-skador. Resultatet visade en signifikant minskning av motiliteten vid 100 μg/mL efter 3 h och med 200 μg/mL efter 1 h, 2 h och 3 h. Livskraften minskade signifikant vid 200 μg/mL efter 2 h och 3 h. Den funktionella integriteten påverkades signifikant vid 100 μg/mL efter 3 h och i dosen 200 μg/mL efter 2 h och 3 h. På samma sätt påverkades spermiekapacitering signifikant vid 200 μg/mL efter 1 timme, 2 timmar och 3 timmar och vid 100 μg/mL efter 3 timmar. DNA-skador ökade signifikant endast i dosen 200 μg/mL efter 3 timmar. Studien tyder på att exponering för acefat kan resultera i förändringar av spermiernas struktur och funktion och därmed bidra till att försämra den mänskliga spermakvaliteten, vilket kan leda till infertilitet.

1. Introduktion

Under de senaste decennierna har flera studier visat på destruktiva reproduktionsfunktioner hos djur och människor på grund av kemikalier och andra giftiga ämnen som tillverkats av människan. Tyvärr har relativt få studier systematiskt behandlat miljöexponeringens inverkan på människors reproduktiva hälsa. Enligt nyligen genomförda studier är det globalt sett varje år cirka 60-80 miljoner par som lider av infertilitet (som inte lyckas bli gravida efter 12 månaders regelbundna oskyddade samlag). Nittioåtta procent av fallen av manlig subfertilitet kan huvudsakligen tillskrivas bristande spermiekvalitet . Subfertilitet kan dock betraktas som idiopatisk och kan vara ett resultat av riskfaktorer som hormonstörande ämnen i miljön, däribland bekämpningsmedel.

Organofosfatbekämpningsmedel är estrar av fosfor- och tiofosforsyra och deras toxicitet har relaterats till deras förmåga att hämma acetylkolinesteras, vilket leder till ackumulering av acetylkolin vid nervförbindelser . Många epidemiologiska studier har visat att det finns ett samband mellan exponering för organofosfatbekämpningsmedel och reproduktionsstörningar som infertilitet, missbildningar, negativa graviditetsresultat och perinatala dödsfall . Fosfororganiska bekämpningsmedel misstänks förändra reproduktionsfunktionen genom att minska hjärnans acetylkolinesterasaktivitet, vilket påverkar hypofysens gonadotropin och orsakar infertilitet . Effekterna på spermakvaliteten kan bedömas med hjälp av parametrar som spermiekoncentration, procent av rörliga spermier och procent av spermier med normal morfologi, tillsammans med parametrar för spermiernas rörelse. Flera studier har visat att män som utsätts för OP löper stor risk att utveckla onormala spermaparametrar, bland annat minskad spermiekoncentration, minskad spermiemotilitet, minskad spermieantal och högre aneuploidi av könskromosomerna i spermier . En studie som genomfördes i Kina med olika OP visade ett tydligt samband mellan förekomsten av metaboliter av insektsmedel i urinen och spermiekoncentrationen och spermiemotiliteten hos nygifta män . In vitro-studier med OP har visat att dessa bekämpningsmedel kan skada DNA i mänsklig sperma och därmed orsaka genotoxiska effekter.

Av de allmänt använda och giftiga OP i Sri Lanka är acefat (O,S-dimetylacetylfosforamidothioat) ett insektsmedel som används inom jordbruket och i hushållet på grund av dess breda spektrum av insekticider. Acefat är ett systemiskt insekticid med kontakt- och magverkan. Acefatets toxiska mekanism tillskrivs inte bara hämning av acetylkolinesteras (AchE) utan även verkan som ett fördröjt neurotoxiskt medel . Sing och Jiang rapporterade att acefat är en potent neurotoxisk, mutagen, karcinogen och cytotoxisk förening. På samma sätt visade Farag et al. att 14 och 28 mg/kg/dag doser acefat minskade spermiernas motilitet och spermiernas antal hos vuxna hanmöss. Ytterligare två studier har bekräftat att acefat signifikant minskar fertiliteten, spermiernas dynamik, könsorganens vikt och könshormonerna hos manliga albinoråttor. I likhet med andra OPs finns det därför en potentiell risk med denna förening för människors reproduktiva hälsa.

Acefat används i stor utsträckning av jordbrukare i Sri Lanka, som befinner sig i sin främsta reproduktiva ålder. Under de senaste två till tre decennierna har det blivit tydligt att yrkesmässig exponering för bekämpningsmedel kan påverka mäns fertilitet , vilket tyder på höga exponeringsrisker för dessa unga odlare. Regleringen av bekämpningsmedel bygger huvudsakligen på djurmodeller, och uppgifterna om människors exponering och spermakvalitet är fortfarande sparsamma och begränsade. Därför genomfördes denna studie för att undersöka effekterna av acefat på mänsklig manlig fertilitet och DNA-integritet hos spermier in vitro.

2. Material och metoder

2.1. Testmaterial

Oformulerad acefat (handelsnamn: Surrender; molekylformel: C4H10NO3PS; molekylvikt: 183,16 g/mol; renhet: 99,0 %; rekommenderad fältdosering av tillverkaren: 1 g acefat i 1 liter vatten) erhölls från Hayleys Agriculture Ltd., Colombo, Sri Lanka. Eftersom acefat är lättlösligt i Biggers Whitten Whittingham (BWW) användes det som kontroll.

2.2. Samling och beredning av sperma

Semenprover samlades in från friska manliga donatorer (ålder 20-30 år) från University of Sri Jayewardenepura, Sri Lanka, i en steril provflaska. Före spermainsamlingen fick donatorerna ett informationsblad och en samtyckesblankett där man frågade efter deras vilja att delta i studien. Alla deltagande personer ombads att avstå från all sexuell aktivitet under 3-5 dagar före spermainsamlingen. Män (medelålder på ) med normal spermiekoncentration, motilitet, morfologi, viskositet, förflytningstid och pH-värde samt avsaknad av omogna former och leukocyter valdes ut för studien. Spermaparametrar (motilitet, vitalitet, hypoosmotiskt svullnadstest och morfologi) utvärderades i enlighet med Världshälsoorganisationens riktlinjer . Eftersom effekterna av acefat kan förstärkas med onormala spermier är det viktigt att välja donatorer med godtagbar spermiekvalitet för studien.

Ett etiskt godkännande (etiskt godkännande ref. nr: 712/13) erhölls av etikprövningskommittén, fakulteten för medicinska vetenskaper, University of Sri Jayewardenepura, Nugegoda, Sri Lanka.

2.3. Bestämning av dosnivåer

För att bestämma dosnivåerna utfördes LD50-värdet av acefat för spermiemotilitet. Därför framställdes ett prov med 1 mg acefat i 1 ml BWW, vilket motsvarar den rekommenderade fältdosen (1 g acefat i 1 liter vatten) av acefat. De beredda proverna späddes därefter med BWW för att få olika koncentrationer av acefat. Spermasuspensioner (fixerade till 50 × 106 spermatozoer/mL) placerades i Eppendorfrör och önskad volym av antingen BWW eller testlösning tillsattes (rörets slutvolym är lika med 1 mL). Proverna blandades noggrant och inkuberades sedan i 1 timme i en fuktig inkubator (Sanyo Electric Co. Ltd., Tokyo, Japan) vid 37 °C i 5 % CO2. Efter inkubationen bestämdes den procentuella rörligheten hos spermatozoerna vid varje koncentration av två oberoende observatörer i Olympus-mikroskop med fas-kontrastoptik (X 400; Olympus Corporation, Japan). Baserat på denna pilotundersökning för att fastställa indikationer på toxiska doser för spermaprover visade det sig att LD50-värdet för acefat är 200 μg/mL. Därför användes subletala koncentrationer under LD50 inklusive LD50-värdet i den aktuella studien.

Den valda dosnivån för den aktuella studien anges nedan: Hög dos: 200 μg/mL (motsvarande LD50-värdet). Mellanliggande dos: 100 μg/mL. Låg dos: 50 μg/mL.Vidare beslutade vi att förlänga tidpunkterna från 1 timme till 2 timmar och 3 timmar för att fastställa de långvariga effekterna av acefat-exponering.

2.4. Bekämpningsmedelsinkubation

Färsk spermaprover () späddes med BWW för att få en slutlig spermiekoncentration på 40 × 106 spermatozoer/mL. Därefter inkuberades proverna antingen med bekämpningsmedel i koncentrationerna 50, 100 och 200 μg/mL eller med BWW. Inkubationerna genomfördes i 1 ml slutvolym i 1, 2 och 3 timmar vid 37 °C i en inkubator (Sanyo Electric Co. Ltd., Tokyo, Japan) i en atmosfär med 5 % CO2 och 95 % O2.

2,5. Bestämning av spermiernas rörlighet

De totala rörliga spermierna uppskattades (cirka 100 celler) av två oberoende observatörer under fas-kontrastoptik (X 400; Olympus Corporation, Japan). Procentuell andel framåtgående motilitet beräknades.

2.6. Cytotoxicitetstest

Spermatozoernas livskraft bedömdes med hjälp av Eosin Y-färgningsteknik och döda och levande spermatozoer beräknades. Procentuell livskraft = (totalt antal celler – antal färgade/totalt antal celler) × 100. Totalt antal celler = 100.

2,7. Bestämning av den funktionella integriteten hos spermiernas plasmamembran

Den funktionella integriteten hos spermiernas plasmamembran bedömdes med hjälp av testet Hypoosmotic Swelling (HOS) som beskrivs av Jeyendran et al. . Minst 100 spermatozoer räknades per preparat.

2.8. Bestämning av kapacitering

En alikvot på 150 μL BWW-medium placerades i en förvärmd kulturskål (35 × 10 mm, Corning, New York, USA) och täcktes med ett förvärmt 22 × 22 mm täckglas. En alikvot på 20 μL spermaprov tillsattes i ett hörn av täckglaset. Kulturskålen placerades i ett inverterat mikroskop (Diaphot, Nikon, London, Storbritannien) med ett termostatstyrt luftvärmeskåp (Nikon, London, Storbritannien) med en temperatur på 37 °C. Spermakapaciteringens status bedömdes på grundval av hyperaktivering genom den objektiva fotografiska metoden med hjälp av ett Olympus IX71 fas-kontrastmikroskop. Eftersom hyperaktivering är ett flagellfenomen är det möjligt att visuellt bedöma hyperaktivering baserat på spermiernas rörlighet; flagellens rörelsemönster utvärderades för att räkna upp ickehyperaktiverade och hyperaktiverade spermier. Experimenten utfördes i två exemplar och upprepades oberoende av varandra fyra gånger.

2.9. Bestämning av DNA-skador i spermatozoer

Spermautstryk preparerades på rengjorda mikroskopiska objektglas och andelen spermier med normalt DNA bestämdes genom att räkna 500 spermier under fluorescensmikroskop (BH-2, Olympus Ltd., Japan) med excitation på 490 nm. Observationstiden för ett enskilt fält var mindre än 40-50 sekunder. Spermier som uppvisar gul till röd färg räknas som denaturerat DNA och spermier som uppvisar grön färg räknas som normalt DNA .

2.10. Statistisk analys

Spermaantalet hos vuxna män var normalfördelat och jämfördes mellan grupperna med tvåvägs variansanalys (ANOVA) med hjälp av programpaketet Minitab (Minitab Co., USA) för huvudeffekt av bekämpningsmedel. När en signifikant behandlingseffekt konstaterades testades skillnaderna mellan enskilda gruppers medelvärden med ”Tukey 95%”. Data uttrycks som medelvärde ± Standard Error Mean (SEM). värdet sattes till .

3. Resultat

3.1. Spermamotilitet

Vid jämförelse med kontrollen minskade den procentuella motiliteten signifikant () (tabell 1) vid medelhög dos (100 μg/mL) med 16 % efter 3 timmars inkubation. Däremot registrerades en mycket signifikant () minskning i 200 μg/mL efter 1 h, 2 h och 3 h inkubation jämfört med kontroller. Vidare är minskningen av motiliteten tydlig i varje dosering med ökande inkubationstid.

3.2. Cytotoxicitet

Den procentuella livsdugligheten minskade (tabell 1) i alla behandlingsgrupper med tiden, men en signifikant minskning (med 20 %; ) uppmättes i 200 μg/mL (hög dos) efter 2 timmar efter inkubation jämfört med kontroller. En mycket signifikant () minskning registrerades i hög dos efter 3 timmars inkubation och den minskade med 31 % jämfört med kontrollen.

3.3. Spermaplasmamembranets funktionella integritet

Tabell 1 visar resultaten av spermiernas funktionella integritet efter 1 h, 2 h och 3 h inkubation. Signifikanta minskningar () av den funktionella integriteten registrerades i mellandosen med 13.5 % efter 3 timmar och även i hög dos med 26 % efter 2 timmars inkubation jämfört med kontrollerna. En mycket signifikant () minskning registrerades i hög dos (med 35 %) efter 3 timmars inkubation.

3.4. Spermakapacitering

Reduktion av kapaciterade spermatozoer observerades i alla behandlingsgrupper (tabell 1). Andelen kapaciterade spermatozoer minskade signifikant () i dosen 100 μg/ml med 18 % efter 3 timmars inkubation och vid hög dosering med 32 %, 36 % respektive 38 % efter 1 timme, 2 timmar och 3 timmars inkubation.

3.5. DNA-skador i spermatozoer

Andelen DNA-skadade spermatozoer ökade med ökad dosering och inkubationstid. Men en signifikant () ökning av DNA-skador registrerades endast vid hög dosering (med 33 %) efter 3 timmars inkubation. Resultaten sammanfattas i tabell 1.

4. Diskussion

OP-insekticider används i stor utsträckning i Sri Lanka med litet eller inget skydd av användarna och individer löper därmed en hög exponeringsrisk. Dessutom är dessa jordbrukare i sin främsta reproduktiva ålder oundvikligen exponerade under en lång tidsperiod. Syftet med denna studie var att påvisa sambandet mellan acefat, ett OP-ämne, med spermakvalitet och DNA-skador i spermier under olika inkubationstidpunkter. Resultaten från denna studie visade att acefat försämrar spermiernas motilitet, livsduglighet, membranintegritet och kapacitering av spermier samt inducerar DNA-skador in vitro. Liknande resultat erhölls med klorerade kolväten , organofosfater och bensenmetaboliter .

Den signifikanta minskningen av spermiernas motilitet som observerades i både medelhög (100 μg/ml) och hög (200 μg/ml) dos av acefat skulle kunna resultera i en försämring av spermiernas befruktningsförmåga . Efter 3 timmars exponering för den högsta dosen minskade den procentuella motiliteten hos spermatozoerna under de värden som rekommenderas av WHO. Spermemotilitet anses vara en av de känsligaste detektorerna för cytotoxiska effekter på spermier och minskning av spermiernas befruktningsförmåga. Förändringar i mitokondriernas membranpotential till följd av olika bekämpningsmedel kan leda till minskad rörlighet hos spermier. Spermamotilitet är också beroende av den intensiva omvandling och energikostnad som produceras via mitokondriernas oxidativa vägar, och bekämpningsmedel kan störa de oxidativa vägarna, vilket leder till försenad spermamotilitet som i slutändan leder till celldöd . Dessutom kan bekämpningsmedelsmetaboliter störa mitokondriernas oxidativa reaktioner, vilket leder till produktion av ett överskott av reaktiva syrearter (ROS) som minskar produktionen av ATP, vilket leder till försämrad rörlighet . Oxidativ stress har rapporterats vara den primära mekanismen för organofosfat, inklusive acefat-toxicitet. Förlust av integritet kan leda till ökad membranpermeabilitet och förlust av förmågan att reglera de intracellulära jonkoncentrationer som är involverade i kontrollen av spermiernas rörelse. Den övergripande effekten av membranskador kan vara ansvarig för den kontinuerliga minskningen av spermiernas rörlighet och livskraft efter utlösning.

Livskraften är andelen levande spermier som bestäms genom utvärdering av cellulär och/eller membranintegritet. Eosinfärgningstestet har gett information om spermiemembranens strukturella integritet, medan HOS-testet har gett information om spermiemembranens funktionella integritet . Spermiernas livsduglighet är förknippad med intakta, funktionella och semipermeabla plasmamembran . Bekämpningsmedel kan leda till att kalciumjoner stiger och skadar spermiemembranen, vilket påverkar spermiernas livsduglighet långt innan de når oocyten . Förändringar i plasmamembranen som observerades i den aktuella studien kan leda till minskad rörlighet, livskraft och membranintegritet hos spermier .

Hyperaktivering är en indikation på att spermier har fullbordat kapacitering och är nödvändig för att tränga igenom cumulusmassan och zona pellucida . I den aktuella studien visades att hyperaktiverade spermier minskade i hög koncentration och minskade med ökad inkubationstid, vilket tyder på försämrad spermiekapacitering. Spermamembran och mitokondrier är viktiga för att driva hyperaktivering och skador på spermamembran och spermamitokondrier kan leda till minskad kapacitet hos spermier. Det är känt att OP försämrar kapacitering genom hämning av AchE när det inkuberas med spermier in vitro . Men efter tillsats av tillräckliga mängder AchE eller AchE-imiterande enzymer i mediet vändes effekten, vilket tyder på att AchE-aktiviteten i spermiemembranen är viktig för att initiera kapacitering.

Denna studie avslöjar en signifikant skada på dubbelsträngat DNA vid den högsta dosen (200 μg/mL) efter 3 timmars inkubation. Integriteten hos spermiernas DNA är avgörande för att överföra genetisk information under reproduktionen och varje skada på DNA kan leda till infertilitet . DNA-baser och fosfodiesterryggbanor är särskilt känsliga för skador orsakade av oxidativ stress eftersom deras plasmamembran innehåller stora mängder fleromättade fettsyror och deras cytoplasma innehåller låga koncentrationer av fångarenzymer . Därför kan höga ROS-nivåer leda till dubbelsträngade DNA-brott som ofta observeras i spermier hos infertila män . Det har konstaterats att acefat avsevärt ökar de cellulära reaktiva syrearterna (ROS), vilket leder till modifieringar av DNA genom att det bildas basparfel och strängbrott . DNA-fragmenterade spermier är mindre rörliga och mindre mottagliga för hypoosmotisk svullnad, vilket tyder på att spermiemembranets funktionella integritet är lägre, vilket leder till att spermiernas funktion försämras med ökande DNA-skador. Bekämpningsmedel som orsakar DNA-skador i leukocyter kan också leda till DNA-skador i spermier.

5. Slutsatser

Denna studie tyder på en möjlig försämring av spermiefunktionen vid acefat-exponering. Hög koncentration av acefat (200 μg/mL, vilket motsvarar LD50) som testades i denna studie förändrade mänskliga spermiernas motilitet, livskraft, plasmamembranets funktionella integritet och spermiekapacitering samt inducerade DNA-skador in vitro. Efter att ha beaktat resultaten och människans naturliga biologiska reaktioner, t.ex. nedbrytning och eliminering av kemikalier, kan man rekommendera att testade högre doser (200 μg/mL) och högre doser kan utgöra en risk för människors hälsa.

Abkortningar

BWW:	Biggers Whitten Whittingham
HOS:	Hypoosmotisk lösning
NaCl:	Natriumklorid
OP:	Organofosfatbekämpningsmedel
ROS:	Reaktiva syrearter.

Etiskt godkännande

Ett etiskt godkännande erhölls från den etiska granskningskommittén, fakulteten för medicinska vetenskaper, University of Sri Jayewardenepura, Nugegoda, Sri Lanka. Ethical clearance number is 712/13.

Intressekonflikter

Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter när det gäller publiceringen av denna artikel.

Acknowledgments

Värderlig hjälp från professor Neelika Malavige, Department of Microbiology, Faculty of Medicine, University of Sri Jayewardenepura, för att tillhandahålla en koldioxidinkubator och Department of Zoology, Faculty of Science, University of Colombo, för att tillhandahålla kemikalier för projektet är mycket uppskattad.