Effekter av statiner på angiogenes och vaskulogenes | Revista Española de Cardiología
INLEDNING
Statiner hämmar aktiviteten hos 3-hydroxi-3-metylglutarylcoenzym A (HMG-CoA) reduktas, ett enzym som katalyserar syntesen av mevalonat, det begränsande steget i kolesterolbiosyntesen.1 Den resulterande minskningen av intracellulärt kolesterol leder till en kompensatorisk ökning av kolesterolupptaget av lipoproteinreceptorer med låg densitet (LDL) och en minskning av plasmakolesterolet. Upptäckten av statinerna och deras användning hos personer med höga kolesterolkoncentrationer har gjort det möjligt att avsevärt förbättra det primära och sekundära förebyggandet av kranskärlssjukdom.2,3 Nyligen har statinernas effektivitet i det primära och sekundära förebyggandet av kranskärlssjukdom också observerats hos personer med lägre kolesterolnivåer.4-6 Förutom att minska LDL-kolesterol (C-LDL) har statinerna en rad pleiotropa effekter på flera komponenter av ateroskleros, inklusive endotelfunktion, cellmigration, inflammation och plackets trombotiska tendens7-12 . Hos normokolesterolemiska djur har det visats att statiner har en skyddande effekt mot ischemi-reperfusionsskador i hjärtmuskeln, troligen genom mekanismer som är relaterade till endotelets produktion av kväveoxid (NO).13
Det serin/treoninproteinkinas Akt eller proteinkinas B (PKB) är en multifunktionell intracellulär regulator av cellulär överlevnad, tillväxt och metabolism 14 (figur 1). När det gäller dess kardiovaskulära funktioner verkar Akt/PKB på den intracellulära väg som stimuleras av vascular endothelial growth factor (VEGF)14,15 och angiopoietin,16-18 vilket främjar cellöverlevnad och säkerställer adekvat vaskulär utveckling.19 Konstitutiv aktivering av Akt-signalering skyddar kardiomyocyter mot apoptos vid ischemi-reperfusionsskador.20 Förutom sin cytoprotektiva effekt fungerar Akt som en aktiverare av NO-produktion av endotelet som svar på VEGF och skjuvstress genom sin förmåga att fosforylera det endoteliala kväveoxidsyntesen (eNOS) i serin 1179 eller 1177,21,22 och på så sätt kontrollera den vasomotoriska tonen.23 Å andra sidan är Akt viktig för endotelcellernas migration till det VEGF-producerande fokuset.24 Akts förmåga att förmedla cellöverlevnad, NO-produktion och VEGF-inducerad migration tyder därför på att proteinkinas Akt kan förmedla endotelresponsen på angiogena stimuli.
Figur 1. Statiner, Akt-signalering och angiogenes/vaskulogenes. Angiopoietin 1 (Ang-1), VEGF och fibroblast growth factor (FGF) inducerar, när de är bundna till sina membranreceptorer, omvandlingen av fosfatidylinositol 4,5-bifosfat (PIP2) till fosfatidylinositol 3,4,5-trifosfat (PIP3) genom fosfatidylinositol 3-kinas (PI3K). Bildandet av PIP3 är nödvändigt för fosforylering av Aktproteinkinas av PDK-1-kinas. Statinbehandling ökar fosforyleringen av Akt, medan wortmanin (en PI3K-hämmare) förhindrar den. Mevalonat, produkten av HMG-CoA-reduktas, hämmar också PI3K och den efterföljande fosforyleringen av Akt. Därför ökar statinerna, genom att hämma HMG-CoA-reduktas och produktionen av mevalonat, Akt-fosforyleringen och samtidigt fosforyleringen och aktiveringen av endotelial kväveoxidsyntes (eNOS), kväveoxidsyntesen (NO) och en rad olika fysiologiska effekter som induceras i angiogenes och vaskulogenes. Akt förhindrar också apoptos av endotelceller.
Det har nyligen visats att statinerna också stimulerar den intracellulära signalvägen för proteinkinas Akt/PKB25-27 i endotelceller25 och de endoteliska progenitorcellerna (EPC) i benmärgen,26,27 vilket inducerar både angiogenes25 och vaskulogenes26,27. Statinernas effekter på EPC:s kinetik har också visats på människor av Vasa et al.28. I denna artikel granskas statinernas effekt på induktion av angiogenes25 och vaskulogenes26 genom mekanismer relaterade till Akt-aktivering.25-27
ANGIOGENESIS OCH VASKULOGENESIS
Angiogenes och vaskulogenes är ansvariga för utvecklingen av det vaskulära systemet i embryot.29-32 Vaskulogenes är processen för blodkärlsbildning från endoteliska progenitorceller (angioblaster) som migrerar och fusionerar med andra endoteliska progenitorceller och differentierar till endotelceller samtidigt som de bildar nya blodkärl. Angiogenes är däremot processen för utvidgning av de blodkärl som har bildats genom att nya kapillärer knoppas genom migration och proliferation av tidigare differentierade endotelceller (figur 2).
Figur 2. Schematisk representation av angiogenes och vaskulogenes. (A) Vaskulogenes är aggregering av angioblaster eller endoteliska progenitorceller för att bilda blodkärl. Angioblasterna sammansmälter in situ eller migrerar för att bilda blodkärl på avlägsna platser. (B) Angiogenes är bildandet av nya blodkärl från redan existerande kärl genom proliferation och migration av differentierade endotelceller. (C) Angiogenes och vaskulogenes kan också förekomma samtidigt. (Taget från Cleaver et al.29)
Man trodde till en början att den vaskulogena processen var begränsad till den embryonala utvecklingen, medan angiogenes (som också sker i embryot) var den enda process som var involverad i neovaskularisering hos vuxna. Paradigmet för postnatal neovaskularisering har dock nyligen setts över och man har upptäckt att endoteliska progenitorceller som cirkulerar i perifert blod,33 införlivas av neovaskulariseringsfoci i vuxna djur,34 de ökar i antal som svar på vävnadsischemi,35 och de främjar utvecklingen av kollaterala blodkärl efter deras expansion in vitro och senare transplantation.36 Dessa studier har fastställt att både angiogenes och vaskulogenes är ansvariga för neovaskularisering hos vuxna.
En tredje mekanism som troligen bidrar till utvecklingen av kollaterala blodkärl är ökningen av storleken och kalibern på redan existerande arteriolära kollaterala förbindelser, en process som kallas arteriogenes.37 Närvaron och antalet av dessa inhemska kollaterala blodkärl varierar kraftigt mellan individer och arter. När ett kärl blir ockluderat sker en ökning av blodflödeshastigheten genom redan existerande kollaterala kärl och en ökning av den luminala skjuvspänningen, faktorer som bidrar till att de kollaterala kärlen mognar, särskilt de av mellanstorlek.
Studiemetoder in vitro
Utvecklingen av tekniker för odling av endotelceller har gjort det möjligt att förstå processerna som är inblandade i angiogenesen.38 Endotelceller i kultur behåller förmågan att reagera på faktorer som stimulerar eller hämmar angiogenes samt förmågan att bilda endotelrör in vitro. Analyser av cellproliferation gör det möjligt att analysera effekten av ett visst ämne på endotelcellsproliferation. Endotelcellernas migration mot en lösning som innehåller en viss substans, separerad av ett permeabelt membran, kan undersökas i en Boydenkammare. Mekanismerna för tubulär endotelbildning och effekten av ett visst ämne på tubuli kan studeras med hjälp av två- eller tredimensionella tester. Med dessa tekniker analyseras processerna för bildandet av endotellumen och den extracellulära matrisens inflytande på kapillärutvecklingen.38 Slutligen gör odlingar av endotelceller det möjligt att studera de molekylära vägar som är involverade i angiogenesiprocesser.
Nu har tekniker som utvecklats för att studera differentierade endotelceller, genom att använda sig av tekniker för cellurval och speciella odlingsmedier, använts för att studera endotelprogenitorceller.33-36
Metoder för studier in vivo
Till trots att tekniker in vitro gör det möjligt att göra en preliminär analys av angiogenes och vaskulogenes finns det många faktorer som kan påverka eller modulera dessa processer in vivo.38 För att studera mekanismerna för blodkärlsbildning in vivo har olika biologiska system utvecklats för att kvantifiera eller påvisa effekten av en viss substans: hornhinnemodeller av mus, chorioalantoidmembran från kycklingembryon eller svampiga implantat.38 Dessa system kräver att djuret offras, vilket gör att de endast fångar effekten i ett specifikt ögonblick. För att studera den tidsmässiga utvecklingen av händelser i en enskild vävnad har intravital mikroskopiteknik utvecklats för huden på ryggen eller skallen på musen39 . Slutligen har utvecklingen av gentekniken gjort det möjligt att studera effekten av att en gen undertrycks (knock-out) eller läggs till (knock-in) i processen för vaskulogenes och angiogenes.
Studien av postnatal vaskulogenes och effekten av vissa ämnen på vaskulogenesprocesserna har varit möjlig tack vare användningen av flödescytometri, fluorescensaktiverad cellsortering (FACS), särskilda tekniker för odling av endoteliska progenitorceller (EPC) från perifert blod och modeller för transplantation av benmärg hos murindjur.33-36 FACS används för att upptäcka och kvantifiera EPC i perifert blod med hjälp av antikroppar mot dessa cellers ytantigen. På detta sätt kan man analysera hur läkemedel eller tillväxtfaktorer påverkar antalet av dessa celler i perifert blod. De speciella tekniker för urval och odling av celler som vår grupp har utvecklat har också gjort det möjligt att upptäcka och kvantifiera EPC. I murinmodellen för benmärgstransplantation transplanteras benmärgsceller från en musdonator till en musreceptor med en gen som kodar för utarbetandet av ett ämne som gör det möjligt att upptäcka det senare (figur 3). I vårt fall kodade genen för framställning av beta-galaktosidas av endotelceller. Selektivt uttryck uppnås eftersom denna gen regleras av en specifik endotelcellspromotor, Tie-2, i musdonatorn. Därför kommer endast endotelceller från benmärgen hos djurdonatorn att uttrycka det betagalaktosidas som kan påvisas i djurreceptorn. Om de biologiska experiment som beskrivs ovan utförs efter benmärgstransplantation i djurreceptorn kan vi analysera ett visst ämnes påverkan på vaskulogenesen genom att kvantifiera antalet endotelprogenitorceller som härstammar från benmärgen.
Fig. 3. Murinmodell för benmärgstransplantation för studier av vaskulogenes. De benmärgsdonatorer som används är transgena möss som konstitutivt uttrycker genen LacZ (som kodar för beta-galaktosidas) som regleras av en specifik endotelpromotor, Tie-2. Benmärgen extraheras och transplanteras till en musreceptor vars benmärg har bestrålats subletalt. Efter en period på 4 veckor för att uppnå rekonstitution av den transplanterade benmärgen görs ett eller flera ingrepp i musreceptorn (det visade fallet är en hornhinnemodell) för att stimulera neovaskularisering. Efter dessa ingrepp offras djuren och en histologisk undersökning görs för att påvisa uttrycket av betagalaktosidas. Med X-GAL-färgningen får celler som uttrycker betagalaktosidas en blåaktig färg. Användningen av en specifik promotor för endotelceller gör att de blå cellerna som har införlivats i neovaskulariseringsfoci kan identifieras som celler av endotelisk härstamning.
EFFEKTER AV STATINER PÅ INDUKTIONEN AV ANGIOGENESIS OCH VASKULOGENESIS
Undersökningar som gjorts i vårt laboratorium och på andra ställen har visat att statinerna stimulerar den intracellulära signalvägen för proteinkinaset Akt/PKB,25-27 vilket främjar både angiogenes25 och vaskulogenes.26 Dessutom har Vasa et al också kunnat påvisa hos människor effekterna av statiner på kinetiken hos EPC.28
Effekter in vitro av statiner
Statinerna aktiverar snabbt proteinkinas Akt/PKB i endotelceller25 och EPC,26,27 och ökar därmed fosforyleringen av eNOS och den efterföljande produktionen av NO. Akt-aktivering genom statiner främjar proliferation, migration och cellulär överlevnad av endotelceller och EPC samt bildandet av den vaskulära strukturen. Dessutom orsakar hämning av Akt genom användning av adenovirus som kodar för dominerande negativa former av Akt en hämning av de effekter som induceras av statiner. Statinernas potential i vävnadsregenerationsprocesser har tidigare visats i osteoblaster. I dessa celler ökade statiner proliferationen och aktivitetsnivån, vilket följaktligen ökade benbildningen.40
Och även om mekanismerna för Akt-aktivering av statiner inte är exakt kända är det troligt att fosfatidylinositol 3-kinas (PI3K)-signalering är inblandad eftersom denna process blockeras av wortmanin och LY294002, två hämmare av enzymet (figur 1). Dessutom är hämning av HMG-CoA-reduktas nödvändigt, eftersom aktiveringen av Akt av simvastatin hämmades genom tillsats av mevalonat i inkubationen (figur 1). Mevalonat är nödvändigt, inte bara för biosyntesen av kolesterol, utan även för produktionen av ubiquinon, dolikoler och isoprenoider, som är viktiga i flera cellprocesser. Även om statinerna stabiliserar messenger RNA (mRNA) för eNOS genom att modifiera isoprenoidsyntesen41 , observerade vi inga förändringar i värdena för proteinsyntesen eNOS. I detta avseende är det viktigt att betona att ökningen av mRNA-koncentrationen skedde senare (24 timmar) än aktiveringen av eNOS-fosforylering av Akt (15 minuter). Denna kortare aktiveringstid stämmer överens med de förändringar som statiner inducerar i produktionen av NO och i den vasodilatation som observeras i aortaannuli ex vivo42 .
Effekter in vivo av statiner
Statinerna och aktivering av intracellulär Akt-signalering främjar angiogenes i modeller av perifer ischemi som utvecklats på normokolesterolemiska kaniner.25 Hos djur som fått statiner observerades högre perfusionstryck, ett större antal kollaterala kärl och en större kapillärtäthet (figur 4). Å andra sidan ökar statinerna antalet endoteliska progenitorceller i perifert blod hos både möss26,27 och människor.28 Dessutom ökar statinerna den korneala neovaskulariseringen hos normokolesterolemiska möss, delvis på grund av vaskulogenes från EPC som erhållits från benmärg (figurerna 3 och 5).26 Med hjälp av murinmodellen för benmärgstransplantation kunde man påvisa ett större antal EPC från benmärg i hornhinnorna hos möss som behandlats med statiner. Statiner har därför en viktig effekt på EPC-kinetiken, vilket tidigare visats med VEGF eller granulocyt- och monocytkolonistimulerande faktor (GM-CSF),35 och statininducerad mobilisering av dessa celler kan öka den postnatala neovaskulariseringen.
Figur 4. Statininducerad ökning av neovaskularisering i benet hos en kanin som svar på unilateral resektion av femoralartären. a) Femoralartären och dess grenar dissekeras. Den genetiska överföringen till endotelet görs genom infusion av adenovirus som kodar för beta-galaktosidas (Ad-βgal) eller Akt (Ad-myrAkt) i den distala femoralartären och inkubation under 15 minuter samtidigt som femoralvenen tillfälligt klämdes. b) På den tredje dagen extraheras muskeln gastrocnemius och X-GAL-färgning görs för att bestämma den transgena fördelningen i histologiska preparat färgade med hematoxylin-eosin. c) Angiografi genom den inre iliakaleden utförs för att analysera bildandet av kollaterala kärl i de olika behandlingsgrupperna. I angiografier gjorda vid 40 dagar syns en ökning av bildandet av kollaterala kärl hos de djur som fick 0,1 mg/kg simvastatin genom intraperitoneal injektion jämfört med de djur som ingreps men endast injicerades med koksaltlösning. Kvantitativ analys av de kollaterala kärlen gjordes i kontrollgruppen, den simvastatinbehandlade gruppen och den grupp djur som fick en intramuskulär injektion av Ad-VEGF. Den angiografiska poängen analyserades i försöksgrupperna som fick en infusion av koksaltlösning, Ad-βgal och Ad-myrAkt 31 dagar efter operationen. d) Färgning för alkaliskt fosfatas i adduktormuskeln i det ischemiska benet visade på en större kapillärtäthet i gruppen djur som behandlades med simvastatin jämfört med kontrollgruppen 40 dagar efter operationen. Data från varje experiment presenteras som medelvärde ± SD (n=6 kaniner i varje behandlingsgrupp, *P25)
Figur 5. Ökning av korneal neovaskularisering genom statininducerad vaskulogenes. a) Representativa fotografier som visar korneal neovaskularisering (vänster, vehikel; höger, simvastatin). b) X-gal färgning av hela hornhinnor. De blåaktiga punkterna är celler som uttrycker beta-galaktosidas (vänster, vehikel; höger, simvastatin). c) Representativa mikrofotografier av den histokemiska studien av fluorescens i paraffinininbäddade hornhinnor från Tie2/LacZ/BMT-möss (vänster, vehikel; höger, simvastatin). Förekomsten av dubbelt positiva celler är ett bevis för att endoteliella progenitorceller (EPC) som erhållits från benmärg har införlivats av neovaskulariseringsfocyterna (vaskulogenes). Den röda färgen visar i detta fall beta-galaktosidas och den gröna färgen visar den specifika endotelmarkören isolektin B4. De dubbelt positiva cellerna (gul färg) är EPC som erhållits från benmärg och som har införlivats av de nya kärlen. d) Representativa mikrofotografier av den histokemiska studien av fluorescens i hela hornhinnor från Tie2/LacZ/BMT-möss (vänster, vehikel; höger, simvastatin). Den röda färgen visar beta-galaktosidas och den gröna färgen visar den specifika endoteliella markören lektin BS-1. e) Kvantifiering av de EPC som härrör från transplantationen och som införlivats i neovaskulaturen. Uttryckt som förhållandet mellan antalet EPC och det totala antalet endotelceller som bildar de nya kärlen. *P26)
KONKLUSIONER
Statiner främjar proliferation, migration och cellulär överlevnad hos endotelceller och EPC från benmärg genom mekanismer som är relaterade till aktivering av serin/treoninproteinkinas Akt eller PKB. På ett sätt som liknar VEGF främjar statiner angiogenes och vaskulogenes. Därför kan Akt-aktivering vara ansvarig för vissa av de positiva effekterna av statiner, inklusive postnatal neovaskularisering.