EMBL – European Molecular Biology Laboratory

Information om formen och konformationen hos ett protein samt interaktionen mellan makromolekyler kan erhållas från de sedimentations- och diffusionskoefficienter som erhålls från ett experiment med sedimentationshastighet. Sedimentationskoefficienter är särskilt användbara för att övervaka förändringar i ett proteins konformation. Den resulterande modellen för proteinets eller proteinkomplexets övergripande form kan jämföras med bilder som erhållits genom elektronmikroskopi för att bedöma hur tillämpbara dessa bilder är på dessa partiklars beteende i lösning.

Association

I motsats till andra metoder för att studera bindningsprocesser är sedimenteringsjämviktsmetoden särskilt känslig för att studera relativt svaga associationer med associationskonstanter (Ka) i storleksordningen 10-100 M-1. Men även bindningsprocesser med Ka-värden som är betydligt större än 107 M-1 kan studeras.

Instrumentet

Den analytiska ultracentrifug som vi har vid EMBL är en Beckman Optima XL-A. Instrumentet snurrar proteinprovet under vakuum vid en kontrollerad hastighet och temperatur samtidigt som det vid bestämda tidpunkter registrerar koncentrationsfördelningen. Beroende på rotorn kan hastigheten vara så hög som 60 000 rpm (vilket motsvarar 250 000 x g). För mätningarna används speciella celler som klarar det höga gravitationsfältet och som tillåter ljuspassage genom provet. Själva provet placeras i en sektorformad kavitet mellan två kvartsfönster (se fig. 1). Detta hålrum är placerat i ett centrum av aluminiumlegering eller förstärkt epoxi. Dubbla sektorceller används också för att kunna korrigera för absorbansen hos provets lösningsmedel. Dessa celler gör det också möjligt att mäta skillnader i sedimentationskoefficienter och diffusionskoefficienter. Centralen har en pathlängd på 3-12 mm, vilket i kombination med valbara våglängder gör det möjligt att undersöka ett brett spektrum av provkoncentrationer. För att ta reda på hur man monterar en cell, gå till monteringsprotokollet.