En lateral flödesremsa baserad på guldnanopartiklar för att detektera 6-monoacetylmorfin i oral vätska

Introduktion

Opioidmissbruket har ökat dramatiskt under de senaste åren och är en viktig orsak till sjuklighet och dödlighet. Enligt World Drug Report 2017 som publicerades av FN:s kontor för bekämpning av narkotika och brottslighet är användningen av opiater och receptbelagda opioider kanske inte lika utbredd som cannabis, men opioider förblir viktiga droger med potentiella skador och hälsokonsekvenser . Därför är enkel och snabb upptäckt av opioider ett brådskande behov.

Illicit heroinmissbruk är en av de vanligaste formerna av opioidberoende. Heroin (diacetylmorfin, diamorfin eller Diagesil®) är ett halvsyntetiskt morfinderivat och ett kraftfullt opioidanalgetikum . Heroinets ämnesomsättning visas i figur 1 . Heroin hydrolyseras snabbt till 6-monoacetylmorfin (6-MAM) och slutligen till morfin. Eftersom heroin hydrolyseras snabbt efter administrering används vanligtvis dess metaboliter för att bekräfta användningen. Dessutom är 6-MAM den enda specifika indikatorn för nyligen genomfört heroinmissbruk jämfört med morfin, och den har väckt stort intresse hos forskarsamhället.

Flera metoder för att upptäcka 6-MAM har beskrivits och dessa kan delas in i följande kategorier: (1) kromatografisk analys inklusive gaskromatografi och högpresterande vätskekromatografi, (2) spektroskopisk analys som Ramen-spektroskopi, infraröd spektroskopi, kemiluminescens etc., (3) kapillärelektrofores och (4) immunoassaymetoder (antigen-antikropp). Komplexa instrumenteringstekniker innebär ett enormt tryck på grundläggande läkemedelsscreening på grund av behovet av sofistikerad utrustning och professionella operatörer. Laboratoriet är ibland stängt eller ligger långt borta. Inte ens polisstationer kan rymma denna komplexa och dyra utrustning. En polisman måste dock omedelbart bedöma om ett misstänkt material innehåller heroin eller inte och måste reagera snabbt. Det finns därför ett brådskande behov av att utveckla specifika, tillförlitliga och enkla metoder för att upptäcka olagliga droger i biologiska prover .

Av metoderna för snabb detektion har kolloidala guldnanopartiklar (AuNP) baserade laterala flödesremsor (LFS) i stor utsträckning antagits för snabb screening på grund av den storleks- och avståndsberoende optiska egenskapen hos AuNP:erna, med den första rapporten av Mirkin och medarbetare . Principen för semikvantitativa laterala flödesanalyser är att AuNP:s röda färg kan ses med blotta ögat från antigen-antikroppskombinationen på flera minuter . Det finns olika kommersiella testkit för upptäckt av heroinmissbruk, bland annat från företagen NovaBios och Wondfo. De flesta heroinscreeningkit mäter dock endast morfin men inte 6-MAM, eftersom det är svårt att skilja mellan 6-MAM och morfin. Morfin kan ha metaboliserats från andra droger eller ha förskrivits. 6-MAM kan entydigt spåras till heroin.

Proverna omfattar blod, plasma, urin, hår, munvätska samt i andedräkt, svett, bröstmjölk, tänder etc. . De vanligaste proverna som används för testning av illegalt heroin är blod, urin och orala vätskor. Av dessa är blodprovet det mest exakta och tillförlitliga, men det är också invasivt. Urintest är det mest bekväma och används i stor utsträckning vid screening av missbruk av droger. Muntvätskor används allt oftare för testning på plats – de är lätta att samla in offentligt. Munvätskor är dock mycket viskösa och har låga koncentrationer av målet; därför använder de flesta testerna urin för 6-MAM-testning. Alla tester för oral vätska som utvecklas kommer att ställas inför samma problem när det gäller insamling av prover och förbättring av känsligheten. En tidigare studie visade att 6-MAM ofta påvisas i munvätska. Detektionsstandarden för LFS i 6-MAM i oral vätska är 4 ng ml-1 . Här har vi utvecklat ett lateralt flödestest för heroin i munvätskeprover.

Vi utforskade AuNPs som antikroppsmärkare i ett lateralt flödestestest för snabb och känslig detektion av 6-MAM via en kolorimetrisk signal. Först syntetiserade vi 6-MAM och konjugerade det sedan till bovint serumalbumin (BSA) för att göra det möjligt att belägga en T-linje. För att övervinna svårigheterna med att hantera prover från munvätska valdes dessutom typerna av nitrocellulosemembran (NC), lösningsformeln för provplattan och den adsorberande svampplattan för att söka de bästa förutsättningarna för LFS för munvätska. Slutligen validerades 6-MAM LFS och visade sig ha en enastående känslighet och specificitet.

Experimentellt

2.1. Material

Antikropparna mot 6-MAM tillhandahölls av Bioventure (Shanghai). BSA och polyvinylpyrrolidon (PVP) köptes från Sigma (Barcelona, Spanien). Triton X-100, Tetronic 1307 (S9), Ohodasurf On-870 (S17) och STANDAPOL ES-1 (S7) köptes från BASF (Tyskland). Destillerat vatten (resistivitet 18,2 MΩ cm-1) framställdes av ett RephiLe PURIST UV Ultrapure vattensystem (Kina). Reel-dispersionssystemet kom från Doyesgo (Kina). Masspektrometern Vion IMS Q-Tof var från Waters (USA). Alla standardmaterial såsom 6-MAM och morfin erhölls från National Institutes for Food and Drug Control (Kina). Mikroskopet var från Motic AE2000 (Xiamen, Kina). Alla andra kemiska och immunologiska reagenser som inte specificeras här var kommersiella standardprodukter av analytisk/reagenskvalitet.

2.2. Komponenterna i lateralflödesremsan

LFS består av ett plastunderlag, en adsorberande svampremsa (svampdyna), en provdyna, en konjugerad dyna, NC-membran och en absorberande dyna. Den adsorberande svampremsan är särskilt utformad för insamling av oral vätska och transporterar snabbt oral vätska till provplattan. Provpaddan innehåller ett buffertsystem och vissa ytaktiva ämnen. Antikropps-AuNP-konjugaten sprayades på konjugatkudden för att reagera med provet och frigöras från kudden för att komma in i NC-membranen som är belagda med 6-MAM-BSA på T-linjen och get-antikroppar mot kanin på C-linjen. Den absorberande plattan är ett filterpapper som är placerat i slutet av remsan och som upprätthåller det kapillära flödet. LFS behöver bara placeras i munnen eller föras in i en provbägare för munvätska. En schematisk bild av LFS visas i figur 2. En schematisk bild av LFS för 6-MAM-detektion visas i figur 3.

2.3. Syntes av 6-monoacetylmorfin-bovin serumalbuminkonjugat

6-MAM framställdes som tidigare beskrivits i forskningsarbeten . Kortfattat framställdes morfin först genom hydrolys av heroinalkali. En N-hydroxysuccinimid (NHS)-estergrupp lades sedan till 6-MAM-molekylen för att konjugera den till bärarproteinerna (figur 4). Det aktiverade 6-MAM säkerställdes av en Waters® Vion IMS Q-Tof masspektrometer. Därefter utfördes syntesen enligt beskrivningen (figur 5) med vissa ändringar. Först lät man 80 mg BSA i 6 ml 50 mM kaliumfosfatbuffert (pH = 7,5) svalna till 0°C. Därefter tillsattes 20 mg aktiverat 6-MAM i 1 ml vattenfri dimetylformamid (DMF) droppvis vid 0 °C. Blandningen värmdes upp till rumstemperatur och rördes över natten. Det resulterande 6-MAM-BSA-konjugatet dialyserades mot 50 mM kaliumfosfatbuffert (pH = 7,5) med sex buffertbyten (minst 6 timmar vardera vid 4 °C).

2.4. Framställning av guldnanopartiklar-antikroppskonjugat

De 20 nm stora AuNPs framställdes via en citratreduktionsmetod . Här tillsattes 2 ml 1 % HAuCl4-lösning i 100 ml kokande vatten under kraftig omrörning och därefter tillsattes omedelbart 2 ml 1 % natriumcitratlösning. När lösningen blev röd kokades den i ytterligare 15 minuter. Lösningen kyldes till rumstemperatur och förvarades vid 4 °C för vidare användning.

Efter att ha justerat pH-värdet för AuNPs-lösningen till 9,0 med 0,1 M K2CO3 tillsattes 30 µg 6-MAM-antikroppar i 10 ml AuNPs-lösning och inkuberades i 30 min. Detta följdes av 20 µl 100,0 g l-1 BSA i 15 minuter för att blockera reaktiva platser. Lösningen centrifugerades vid 3740 g i 15 minuter och supernatanten återcentrifugerades vid 12 100 g i ytterligare 30 minuter. Alla guldutfällningar blandades och mättes för att identifiera den maximala absorbansen med hjälp av UV-visionsspektroskopi. Det förvarades sedan vid 4 °C för vidare användning.

Samma metod användes för att konjugera AuNPs till IgG-antikroppar från kanin. Vid tillverkningen av konjugatkudden späddes antikroppskonjugaten till absorbans fem med buffert (0,05 M Tris-HCl innehållande 10,0 g l-1 BSA, 0,4 % Triton X-100, 5 % trehalos, 10 % sackaros, pH 8,2). Slutligen sprayades 500 µl av blandade AuNP-antikroppskonjugat på en 20 mm2 glasfiber och torkades sedan vid 37 °C över natten.

2.5. Förberedelse av belagda nitrocellulosemembran

För att göra testremsan för lateralt flöde fördelades 6-MAM-BSA-antigen (0,6 mg ml-1) på NC-membranen som testlinjer (T-linje). Kontrolllinjerna (C-linje) var belagda med polyklonala antikroppar av get-antikit (0,15 mg ml-1). De belagda NC-membranen torkades vid 37 °C över natten. Nio kommersiella NC-membran från fyra företag utvärderades: Millipore (HF90, HF135 och HF180), GE-Whatman (FF120HP och AE100), Sartorius (CN95 och CN150) och Pall (Vivid90 och Vivid170).

2.6. Känslighet och specificitet

Strippen är en kompetitiv analys, och båda positionerna hade 6-MAM-strips. När provet innehåller 6-MAM binder det till den nanogoldmärkta antikroppen på den konjugerade tampongen. Överskottsantikroppar fortsätter att avancera längs den kromatografiska riktningen på grund av kapillärverkan och binder sedan till 6-MAM-antigenet på T-strecket. T-linjens signalintensitet är direkt relaterad till 6-MAM-koncentrationen i provet. En mörkare färg indikerar en lägre 6-MAM-koncentration.

Negativ munvätska samlades in från sex personer och spetsades med 6-MAM (400, 100, 40, 10, 4, 1, 0,4, 0,1 ng ml-1) för känslighetsdetektion. Tio vanliga missbrukade droger användes för att verifiera LFS:s specificitet. Dessa droger var morfin (MOP, 100 µg ml-1), kodein (COD, 100 µg ml-1), tetrahydrocannabinol (THC, 10 µg ml-1), metylendioxymetamfetamin (MDMA, 100 µg ml-1), ketamin (KET, 100 µg ml-1), metylamfetamin (MET, 100 µg ml-1), kokain (COC, 100 µg ml-1), metadon (MTD, 100 µg ml-1), efedrin (EPH, 100 µg ml-1) och pseudoefedrin (PEPH, 100 µg ml-1).

Resultat och diskussion

3.1. Syntes av 6-monoacetylmorfin-bovin serumalbumin-konjugat

NC-membran brukar först beläggas med ett bärarprotein före konjugering av antikropp. Länkare används för att bibehålla strukturell specificitet. Här tillsattes först en NHS-estergrupp till 6-MAM-molekylen som en länk för bärarproteinet. Detta validerades med en Waters® Vion IMS Q-Tof masspektrometer. Vi fann en bred topp i UPLC-kromatogrammen (ultrapresterande vätskekromatografi) av aktiverad 6-MAM vid 8,8 minuter med en m/z på 706,27645 (figur 6) jämfört med en förutspådd m/z på 706,2758. Detta tyder på att länkaren var framgångsrikt fäst vid 6-MAM. Betydelsen av exakt syntes är självklar eftersom endast strukturen är korrekt fastställd, och detta skulle kunna leda till parning med 6-MAM-antikroppar.

Vi använde inte gradientdialys av dimetylsulfoxid eftersom produkten är löslig och det tidigare konjugeringsprotokollet är för komplicerat. BSA hade flera toppar i UPLC-kromatogrammet (data visas inte) på grund av de olika analogerna. Detta ledde till en rad olika konjugationsförhållanden. Därför fanns det olika toppar i UPLC-kromatogrammet som motsvarade de olika konjugeringsförhållandena. Konjugationsresultaten kunde bekräftas effektivare genom antigen-antikroppsparning än genom konjugeringskvoten.

3.2. Typer av urval av nitrocellulosamembran

NC-membran binder proteiner elektrostatiskt via interaktioner mellan nitratesterns starka dipol och den starka dipolen i proteinets peptidbindningar. Egenskaperna inklusive kapillärflödeshastighet, signalintensitet och bakgrund utvärderades eftersom de kan påverka den slutliga prestandan hos LFS. Dessutom ägnas flödeshastigheten större uppmärksamhet eftersom den kan påverka proteinets adsorptionskapacitet och även känsligheten. Flödeshastigheten hos ett membran beror på de aggregerade egenskaperna hos de porösa strukturerna, t.ex. porstorlek, porstorleksfördelning och porositet. En större porstorlek leder till svagare proteinadsorption.

Vi jämförde nio NC-membran (tabell 1). Varje test upprepades tre gånger och det genomsnittliga resultatet registrerades. LFS-resultaten mättes på 3 minuter, och det bästa provflödet var under 20 s cm-1. Signalintensiteten vid T-linjen behövdes också på normal nivå. En djupare bakgrundsfärg försvårade noggrannheten. Millipore-membranet HF135 var det bästa valet för 6-MAM efter ett omfattande övervägande av provflödeshastighet, signalintensitet vid T-linjen och bakgrundsfärg.

3.3. Provplattan

Lösningen för behandling av provplattan är mycket viktig för testet eftersom den fungerade som reaktionsbuffersystem när proverna från munvätska rehydrerar provplattan. Lösningen innehåller vanligtvis ett buffertsystem med lämplig jonstyrka och pH-värde; vissa blockerande material och ytaktiva ämnen kan påskynda flödeshastigheten för oralvätska på membranet. Provpaddan tar hand om komplexiteten i munvätskans matrixeffekter och gör den kompatibel med NC-membranet. Dessutom säkerställer buffertsystemet frisättningen av analyter och stabiliserar flödeshastigheten eftersom den orala vätskan är för viskös.

Fyra olika formler övervägdes. Lösningsformlerna anges i tabell 2. Resultaten visade att buffertsystem 4 med det ytaktiva ämnet STANDAPOL ES-1 (S7) gav den bästa prestandan vid en provflödeshastighet på 17 s cm-1, med en normal signalintensitet och en vit bakgrund. Tensiden S7 är en stark anjonisk tensid som ger starkare tvättförmåga än S17 och S9.

3.4. Insamling av orala vätskor

Oralvätskor är svårare att samla in än urin på grund av deras höga viskositet. Det finns många olika typer av anordningar för insamling av oralvätska: bomullstops, svampar, plaströr och muggar. Vissa metoder stimulerar orala vätskor via ättika, munvatten, sugtabletter osv. Sådan stimulering kan dock ändra koncentrationen av analyter i munvätskan och är mer komplicerad och tidskrävande. Vi samlade slutligen upp oral vätska direkt från munnen med hjälp av en svampadsorbent (ESSENTRA, UK), som är en blandning av polymerfibrer med lämplig porstorlek.

Två typer av svampadsorbenter (K1 och K2) var specialdesignade, och strukturerna hos de båda svampkuddarna visas i figur 7. K2 var mycket lösare och regelbunden i förhållande till K1. Båda utvärderades genom att testa vätskehanteringsförmågan, bland annat genom att släppa vatten på svampkudden, lägga den slutliga LFS i den negativa kaliumfosfatbufferten (pH = 7,0) och lägga den slutliga LFS i munnen. K2-svampen hade ett dubbelt så snabbt provflöde (i genomsnitt 20 s cm-1 ) som K1-svampen för vatten, PBS-buffert eller riktiga orala vätskor. Detta är en mycket viktig fråga för testning av orala vätskor. Sammanfattningsvis valdes K2 på grund av dess utmärkta prestanda vid hantering av prover från orala vätskor.

3.5. Känslighet och specificitet

Små molekyler detekteras vanligtvis via en kompetitiv analys i LFS. Här finns det ingen signal (röd linje) i T-linjen. Detta representerar en koncentration av 6-MAM i provet som ligger över gränsvärdet. Känsligheten för test av oral vätska bör vara mycket högre än för urinprov på grund av den låga koncentrationen av läkemedelsmetaboliter i oral vätska. Här har vi framgångsrikt gjort en kvalitativ LFS för 6-MAM med en känslighet på 4 ng ml-1 , vilket uppfyller kraven för allmänna detektionsgränser för oral vätska . Resultaten visas i figur 8. Dessutom visar figur 9 specificiteten i förhållande till de vanligaste missbrukade drogerna. LFS för 6-MAM var specifik för 6-MAM utan någon korsreaktion särskilt med morfin eller kodein.

Slutsats

6-MAM är den specifika metaboliten av heroin. Vi rapporterar här en LFA för 6-MAM via ett särskilt konjugat parat med en specifik antikropp. Vi tillverkade ett konjugat som kopplade 6-MAM till bärarproteinet via en NHS-estergrupp i C3-positionen (figur 10). Här identifierade antikroppen acetylgruppen i 6-MAM. Detta är en förutsättning för specificitet för 6-MAM. Slutligen har vi gjort ett mycket känsligt LFS-test utan korsreaktioner med 10 vanliga missbrukade droger, inklusive morfin och kodein. Vi identifierade de rätta NC-membranen, provplattan, porstorleken och svampadsorbenten för att göra ett test som använder orala vätskor vid vårdtillfället.

Med ovanstående fördelar skulle 6-MAM LFS för prov från munvätska kunna användas inom både forskning och industri. Den skulle kunna hjälpa polisen att spara arbetskraft och tid/kostnader vid förundersökningar. Oralvätska är bekvämt och mindre invasivt och lämpar sig för trafikscreening. Sammanfattningsvis är en LFS för heroinmissbruk i oral vätska inriktad på 6-MAM en lovande produkt för att bekämpa drogpåverkan vid bilkörning.

Etik

Användningen av heroinproverna för forskning övervakades av det tredje forskningsinstitutet vid det kinesiska ministeriet för offentlig säkerhet. Alla författare förklarar att de följer de etiska normerna.

Datatillgänglighet

Data är deponerade i Dryad Digital Repository: https://doi.org/10.5061/dryad.8r36rp3 .

Författarnas bidrag

L.Z. utformade den här studien, och X.H. och J.Z. hjälpte till att utföra experimenten i figurerna 4 och 5. F.C. och Y.Z. utförde studierna i figur 6. J.L. analyserade data och skrev artikeln. Alla författare gav sitt slutliga godkännande för publicering.

Kompletterande intressen

Vi förklarar att vi inte har några konkurrerande intressen.

Finansiering

Ingen finansiering har erhållits för denna artikel.

Disclaimer

Alla åsikter, resultat och slutsatser eller rekommendationer som uttrycks här är författarnas egna.

Fotnoter

Denna artikel har redigerats av Royal Society of Chemistry, inklusive beställning, peer review-process och redaktionella aspekter fram till godkännande.