Förståelse av den strukturella grunden för hiv-1 restriktion genom den fullständiga dubbeldomänen APOBEC3Gdomän APOBEC3G

Allmänna strukturella egenskaper hos fl rA3G

Ett stort hinder i strukturstudier av fl dubbeldomän APOBEC-proteiner har varit dålig löslighet – former av vildtyp renas ofta antingen som icke-homogena oligomerer eller stora aggregat vid högre koncentration. För att få fram välmående fl A3G för strukturbestämning screenade vi A3G-homologer från olika primatarter och fann att A3G från rhesusapa (rA3G) hade bättre löslighet. Två fl rA3G-mutationskonstruktioner (kallade FKL och E/Q) gav välmående proteiner och kristaller under olika förhållanden (kompletterande tabell 1) som diffrakterades till 2,47 respektive 2,40 Å (kompletterande tabeller 1 och 2, kompletterande figur 1). Ytterligare förändringar i dessa två konstruktioner förbättrade lösligheten och utbytet av rA3G, bland annat genom att ersätta en 8-residue CD1 loop 8 med 4-residue loop 8 från hA3G-CD2 (som i både E/Q- och FLK-konstruktionerna, kompletterande tabell 1, kompletterande figur 1). 1), ytterligare mutationer F126Y i CD1-slinga 7, K180S/L184S i CD1 h6 och borttagning av 8-residualer i CD2-slinga 3 (som i FKL-konstruktionen, kompletterande tabell 1, kompletterande figur 1B). Det bör noteras att K128 i rA3G, som fungerar som barriär för överföring mellan olika arter, är muterad till en asparaginsyrarest (D128) som i mänsklig A3G (hA3G)36. Konstruktionerna innehåller också en katalytisk E259- till Q/A-mutation för att undvika potentiell toxicitet vid rekombinant proteinuttryck. De muterade resterna och deras placering på strukturen visas i kompletterande figur 1B. I båda strukturerna är CD1 och CD2 vikta till fristående domäner som är förbundna med en kort länkare med 5 resider (residerna R194 till D198) (fig. 1a, b). De två strukturerna visar, trots övergripande strukturell likhet (fig. 1a, b), uppenbara skillnader i CD2-konformationerna och packningsorienteringen mellan CD1 och CD2 (fig. 1c, kompletterande fig. 2A).

Både rA3G FKL- och E/Q-strukturerna har samma kanoniska CD1-struktur och överlagrar väl över varandra (kompletterande figur 2B, rmsd på 0,445 Å). De mycket större konformationsskillnaderna i varje CD2-domän resulterar i en rmsd för överlagring på 0,862 Å. När FKL- och E/Q-strukturerna anpassas via deras CD1-domän visar CD2-domänen i E/Q-strukturen en rotation på ~29° jämfört med CD2-domänen i FKL-strukturen, vilket gör att E/Q:s CD2-domän förskjuts ~15 Å nedåt och ~8 Å mot CD1, vilket resulterar i en mycket närmare packningsinteraktion med CD1 (kompletterande figur 2 A). Det övergripande CD1-CD2-packningsgränssnittet har en begravd yta på ~623 Å2 för FKL-strukturen och ~700 Å2 för E/Q-strukturen. Den tätare CD1-CD2-packningen i E/Q-strukturen leder endast till en något större begravd yta än i FKL-strukturen, troligen på grund av omvikningen och den saknade tätheten hos de gränssnittslokaliserande strukturella elementen (h2-loop3) i dess CD2.

Två typer av interaktioner mellan CD1- och CD2-domäner

Men medan FKL-strukturen visar en kanonisk veckning av dess CD2-domän (kompletterande figur 2C), visar E/Q-strukturen betydande förändringar i CD2-konformationen (kompletterande figur 2D), med stora förändringar på helix 2 (h2), slinga 3, slinga 4 och det Zn-aktiva centret. CD2:s långa h2 i FKL-strukturen (kompletterande figur 2C) har blivit en kort 310-helix (h2′) i E/Q-strukturen (kompletterande figur 2D), vilket resulterar i en oordnad 14-residualsträcka som sträcker sig över delar av slinga 3 och h2 (resterna A246 till E259) (kompletterande figur 1A). Skiftet till en kort 310 h2 och förlängd slumpmässig spiralstruktur är nödvändigt för att undvika kollisioner i denna konformation med tät packning (fig. 1e). Detta stör dock också konformationen av CD2:s Zn-aktiva centrum inom de regioner av h2 och slinga 3 som blir oordnade, vilket resulterar i ingen Zn-koordination (kompletterande fig. 2D). Avsaknaden av Zn-koordination observeras endast i en annan APOBEC, APOBEC3F (A3F) CD2-strukturen46,47. De Zn-innehållande eller frånvarande A3F-CD2-strukturerna är dock i huvudsak identiska, vilket också stämmer väl överens med flera andra APOBEC-strukturer (kompletterande figur 2E), medan E/Q-CD2 är unik i sina omvikta h2-slingor 3 och 4 och konformationen med Zn-centrum (kompletterande figur 2E). 2E, F).

Samtidigt som det är möjligt att förlusten av Zn och omvikningen av CD2 i E/Q-strukturen kan vara resultatet av mutationerna i denna konstruktion, undersökte vi om E/Q-varianten har defekt katalysaktivitet. Reversion av E259Q i E/Q-konstruktionen tillbaka till den WT-katalytiska E259 (E/Q*-konstruktionen) gav varianten full aktivitet i deamineringsanalysen med hjälp av HEK293T-celluttryckslysat (kompletterande fig. 3). Dessutom är E/Q* som bär enskilda mutationer F126Y, K180S/L184S eller CD2Δloop3 (som i FKL-konstruktionen) alla aktiva, även om aktiviteten hos FKL*-konstruktionen (med E259A återställd till E259) med de kombinerade mutationerna är mindre än E/Q* och WT. Dessa resultat tyder på att även om den kristalliserade E/Q-strukturen, som saknar Zn i CD2-domänen, representerar ett katalytiskt inaktivt A3G-strukturtillstånd, kan en omvändning av den katalytiska residen tillbaka till E259 helt återställa dess deaminasaktivitet som är jämförbar med WT. Kombinerade mutationer i FKL påverkar delvis dess katalytiska aktivitet.

På grund av den ~29° stora skillnaden i den relativa rotationsvinkeln i packningen mellan varje domän i FKL- och E/Q-strukturerna skiljer sig de detaljerade molekylära interaktionerna mellan CD1 och CD2 mellan de två strukturerna. CD1- och CD2-domänerna i FKL-strukturen interagerar med varandra huvudsakligen genom h3, h4 och slinga 7 i CD1 och h1, h2, β2 och slinga 3 i CD2 (fig. 1a, d). I E/Q-strukturen interagerar de två domänerna huvudsakligen genom h3, h4 och h6 i CD1 med h2′, β2, slinga 4 och slinga 10 i CD2 (fig. 1b, e). Som ett resultat av detta skiljer sig cirka 40 % av de interagerande resterna mellan CD1 och CD2 åt i de två strukturerna (se en fullständig lista över de interagerande resterna i kompletterande figur 4), och även när samma rester deltar i denna interaktion gör de ofta olika bindningskontakter på grund av förändringen i packningsvinkeln mellan de två domänerna. Förmågan att packa CD1- och CD2-domänerna med olika vinklar och restinteraktioner indikerar en viss grad av plasticitet i domänarrangemanget hos fl A3G.

Fullängds rA3G-dimer och egenskaper hos dimeriseringsområdet

E/Q-konstruktionen kristalliserades i olika pH- och saltförhållanden (kompletterande tabell 1), men uppvisade konsekvent samma struktur och dimerisering via CD1-CD1-interaktioner (fig. 2a, b), främst genom direkt packning av flera rester på h6 (K180, L184, A187), slinga 1 (I26) och slinga 7 (F126, W127) från båda underenheterna (kompletterande fig. 5A, B). Intressant nog är dessa interaktioner identiska med dem som tidigare rapporterats för enbart rA3G-CD1-domänen18 , trots att man inkluderat K128D-mutationen som är kritisk för att vända rA3G från hiv-1 Vif okänslig till känslig för nedbrytning. Det är värt att notera att en sådan dimerisering av fl rA3G endast leder till en liten ökning av den största dimensionen från 85 Å för en monomer till 95 Å för en dimer (fig. 2a, b).

En detaljerad undersökning av de rester som är inriktade på vardera sidan om det dimeriska gränssnittsområdet avslöjar två framträdande drag. För det första är sammanlagt 18 positiva/polära och hydrofoba rester inriktade runt rA3G-dimerövergången på ett sätt som lämpar sig för interaktion med enkelsträngade nukleinsyror, t.ex. RNA (inlaga B i fig. 2). Dessa 18 rester är organiserade i två uppsättningar, med den första uppsättningen medurs med början från den övre monomeren (i grönt), R24, H181, N177, N176, K180, och fortsätter till den nedre monomeren (i ljusblått) W127, Y125, Y124 och S28, och sedan med den speglade uppsättningen av samma rester. För det andra, genom dimerisering, är R24 och de närliggande positiva resterna K180 och H181 i varje monomer placerade nära varandra i rummet, med ungefär 7 Å avstånd mellan de två R24-resterna. Detta rumsliga arrangemang ökar avsevärt de lokala elektrostatiska potentialerna (EP) från cirka +1,9 kT/e som monomer till +8,3 kT/e som dimer (fig. 2c och inlaga C, fig. 2d och inlaga D). Närvaron av väljusterade rester som lämpar sig för att binda enkelsträngade nukleinsyror samt den förstärkta positiva EP (PEP) runt den observerade dimerövergången antyder starkt att detta område kan binda RNA som en dimer, och antyder att en störning av detta A3G-dimeriseringsgränssnitt kan påverka RNA-bindningen genom att den förstärkta PEP (Fig. 2c) bryts till den låga PEP som i en monomer form (Fig. 2d).

Dimermutationseffekt på RNA-association och multimerisering

Vår tidigare studie av enbart CD1-domänen föreslog att dimergränssnittsresterna FWKL (F126, W127, K180, L184) kan vara involverade i både dimerisering och RNA-bindning, antingen genom direkt interaktion med RNA eller indirekt genom att generera en RNA-bindningsyta via dimerisering18. Inspektion av fl rA3G dimerstrukturen avslöjar att medan resterna FWKLA (F126, W127, K180, L184, A187) direkt deltar i dimeriseringsinteraktioner (Supplementary Fig. 5A), är det bara W127 som är tillgänglig för pi-stackning eller vätebindning med en nukleinsyrabas, vilket tyder på att det är W127 som har de kritiska dubbla rollerna i dimerisering eller/och RNA-bindning, vilket också har föreslagits av tidigare mutationsstudier15,18,40,48.

Loop 7 av rA3G ligger nära dimeriseringsgränssnittet och innehåller en uppsättning hydrofoba rester (Y124, Y125 och F126) som packar med och sannolikt stabiliserar W127 (kompletterande figur 5B). För att ta reda på om dimerisering behövs för RNA-association och för att även överväga den möjliga dubbla rollen för W127, utformade vi en uppsättning dimergränssnittsmutanter av rA3G som lämnade slinga 7 oförändrad (kompletterande tabell 3, kompletterande fig. 5A, B). Som sådan muterades endast begravda gränssnittsrester utanför slinga 7, vilket genererade mutanterna rM10, rM11 och rM15 (kompletterande tabell 3). Som kontroll inkluderade vi också en mutant rM9 med förändringar på både loop 7 och h6 av CD1 (F126A-W127A-A187Y) som förväntades resultera i en liknande fenotyp som den tidigare rapporterade FWKL-mutanten av enbart CD118; dvs. störning av både dimerisering och RNA-association. En nästan vildtyp rA3G (WT) med ett löslighetshöjande loopbyte på CD1 loop 8 och dess motsvarande katalytiskt inaktiva mutant (konstruktion E/Q) ingick också (kompletterande tabell 3). RNA-associationen och oligomeriseringsstatusen för dessa mutanter efter rekombinant uttryck i E. coli undersöktes.

Efter affinitetskolonnrening från E.coli-celllysaten analyserades RNA-associationen av sumo-rA3G-fusionsproteinet genom denaturerande urea-PAGE (fig. 3a-c). Medan WT och E/Q-mutanten (körfält 7, 8 i fig. 3b, c) hade liknande RNA-association, hade alla dimer-interface-mutanter (rM10, rM11, rM15 i körfält 2, 3, 5 respektive i fig. 3b, c) hade kraftigt minskad RNA-association (körfält 7) före eller efter behandling med RNas A. rM10 (T183D-L184D-A187Y), rM15 (I26A-K180S-L184S-A187E) och kontrollmutanten rM9 uppvisade knappt påvisbart RNA efter att ha genomgått samma reningsprocess (körfält 1, 2, 5). Storleksuteslutningskromatografi (SEC) visade att rM10 och rM15, liksom kontrollmutanten rM9, eluerades huvudsakligen som en monomer före och efter behandling med RNase A (fig. 3d, e; kompletterande fig. 6A, B), vilket bekräftar att dimeriseringen/multimeriseringen har brutits. Således tyder dessa resultat på att under de experimentella förhållandena tyder på att mutationer av rester som är begravda i gränssnittet inte bara bryter dimeriseringen utan även påverkar RNA-associationen även när slinga 7 är oförändrad, troligen på grund av förlusten av den förstärkta PEP som ett resultat av dimerupplösningen (Fig. 2c, d).

Om vi inte kunde utföra samma typ av biokemisk analys för att bedöma liknande mutanter i humant A3G (hA3G) på grund av dess dåliga löslighet, genererade vi en rA3G-hA3G-chimera-mutant (h6-chimera) där rA3G CD1 h6 ersätts med hA3G CD1 h6 (se kompletterande tabell 3). Denna h6-chimera uppförde sig på samma sätt som rA3G WT under rening när det gäller dimer/multimerisering före eller efter behandling med RNas A (kompletterande figur 7A, B) samt RNA-association, särskilt efter behandling med RNas A (kompletterande figur 7C, D). Det är värt att notera att, som visas i kompletterande fig. 7A, B, medan H6 chimärprotein också skiftade till dimer (D) och monomer (M) fraktioner efter RNase A behandling (SDS-PAGE gel i kompletterande fig. 7D), visar dess SEC-profil mer heterogena toppar än den för rA3G WT, möjligen på grund av att det chimära proteinet har tre rester (Y181, I183, I187) från hA3G som är mer hydrofoba än de i rA3G (H181, T183, A187), och därmed mindre stabila/lösliga. Dessa resultat tyder på möjligheten att CD1 h6 kan vara utbytbar mellan rA3G och hA3G, vilket leder till förekomsten av samma PEP-område som i huvudsak har samma uppsättning ytrester på båda proteinerna.

PEP-mutationseffekt på RNA-association och multimerisering

Vi undersökte sedan om den förstärkta PEP-yta som bildas runt dimerförbindelsen (Fig. 2. Insats b) har betydelse för RNA-association. Fyra positiva/polära rester centrerade runt R24 muterades för att generera rM12 (R24T-S28A-N176A-N177D, kompletterande tabell 3). En mutant som enbart innehåller R24T ingick också. RNA-associeringen av rM12 minskade jämfört med R24T och WT (körfält 4, 6, 7 i fig. 3b, c), vilket tyder på att dessa rester inom PEP-området spelar en roll för att öka RNA-bindningen. Jämfört med rM9 (F126A/W127A/A187Y) hade rM12 dock fortfarande en betydande mängd RNA-association före och efter behandling med RNase A (körfält 1, 4 i fig. 3b, c), möjligen på grund av en partiell störning av RNA-bindningen till PEP-området men inte till andra områden av rA3G. Oväntat nog visade SEC-analysen att rM12 hade en större monomerisk topp även före RNase A-behandlingen (fig. 3d, e, kompletterande fig. 6A, B), vilket tyder på att dimeriseringen/multimeriseringen störs utan att dimeriseringsgränssnittet muteras direkt. Denna negativa effekt av PEP-mutationen på RNA-association och dimerisering/multimerisering bekräftades ytterligare av ytterligare två rA3G-mutanter som innehåller PEP-mutationer, rM13 och rM14 (Supplementary Table 3, Supplementary Fig. 7). Dessa två mutanter visade olika nivåer av störning av RNA-association (Supplementary Fig. 7A) och dimerisering/multimerisering även före RNase A behandling under de testade förhållandena (SEC-profiler och geler i Supplementary Fig. 7C).

Interessant nog, även om R24T singelmutant och WT visade liknande mängder associerat RNA som detekterades av RNA-geler i Fig. 3b, c, visade den detaljerade SDS-PAGE-analysen av deras SEC-toppfraktioner före RNase A-behandling att det mesta av R24T-proteinet fördelades i fraktionerna som spreds runt den monomera toppens (M) placering (Supplementary Fig. 6A), vilket står i motsats till WT som mestadels är fördelat i fraktionerna med tom volym (V). Dessa resultat indikerar förändring av RNA-association och multimeriseringsbeteende med en enda R24T-mutation inom PEP-området, vilket stämmer överens med tidigare studier av R24A-mutationer14,30,38,40. Sammantaget visar dessa resultat att, under dessa testförhållanden, spelar rester inom det förstärkta PEP-området i dimerförbindelsen (R24/S28/N176/N177) en viktig roll för att förmedla RNA-association, och RNA-association genom dessa rester är omvänt nödvändig för att stabilisera dimeriseringen och efterföljande multimerisering av högre ordning.

Effekt av PEP/dimer-mutationer på in vitro RNA/DNA-bindning

Fl rA3G-strukturerna avslöjar ytterligare områden med positivt laddade rester utanför det förstärkta PEP-området som visas i fig. 2c. Även om dessa positivt laddade rester utanför PEP-området kanske inte spelar någon större roll för att bilda stabila A3G-RNA-komplex som observerats från E. coli-celllysat, kan de ändå bidra till att binda de definierade ssRNA- och ssDNA-substraten. För att testa detta utsattes varje renat proteinprov för omfattande RNasbehandling för att avlägsna så mycket bundet RNA som möjligt, och bindningsaffiniteten mot 50 nt ssRNA- eller ssDNA-oligomerer testades med hjälp av en gelskiftesanalys. Alla mutanter uppvisade bindning till 50 nt ssRNA eller ssDNA, och de uppskattade dissociationskonstanterna (Kd, kompletterande tabell 3) visade att de flesta mutanter hade minskad bindning jämfört med WT och E/Q. Dessa resultat tyder på att i detta rekonstruerade system där höga koncentrationer av proteiner och nukleinsyror var närvarande, är dessa olika rA3G-dimergränssnitt och PEP-området mutanter fortfarande kapabla att binda till RNA och ssDNA genom andra rester utanför PEP-området vid dimerövergången.

Totalt sett är minskningen av bindningen hos dessa mutanter allvarligare för ssDNA-bindning än för RNA-bindning. Intressant nog visade deaminasanalysen med hjälp av de renade proteinerna från dessa rA3G-mutanter (rM9-rM12 och rM15) att dessa dimergränssnittsmutanter och RNA-bindningsmutanter alla uppvisade minskad deaminasaktivitet jämfört med WT (kompletterande figur 8). Den sänkta ssDNA-bindningen hos dessa mutanter skulle åtminstone delvis kunna förklara de olika nivåerna av minskad deaminasaktivitet. Graden av sänkt ssDNA-bindning verkar dock inte ha någon strikt korrelation med störningsnivån för deaminasaktiviteten. Till exempel uppvisade rM12 den lägsta ssDNA-bindningen (kompletterande tabell 3) men är inte den med lägst deaminasaktivitet (kompletterande figur 8).

Effekter av PEP/dimer-interface-mutationer på hiv-restriktion

Den kända W127A-mutationen på mänsklig A3G (hA3G) stör virionförpackningen och därmed hiv-restriktionen, troligen genom att upphäva RNA-bindningen som förmedlas av denna rest. Studier som har inducerat paketering av W127-mutanter av hA3G genom en Vpr-peptidfusion har dock identifierat brister i hiv-begränsningen15. För att få ytterligare insikter i mekanismen för hiv-1-begränsning genom hA3G utformade vi ytterligare hA3G-mutanter som styrdes av rA3G-strukturen och mutationsdata. Avsikten med dessa hA3G-mutationer (kompletterande tabell 4) var att störa de intramolekylära CD1-CD2-interaktionerna (M2, M3, M4) (kompletterande figur 9A, B), störa RNA-bindningen runt dimerförbindelsen genom att mutera ett ökande antal polära/laddade rester (M12, M13, M14), eller att störa interaktionerna mellan protein och proteindimer genom att mutera ett ökande antal nedgrävda rester (M6, M10, M11) (kompletterande figur 9A, B).

Som väntat hade WT hA3G ingen hiv-1-begränsningsaktivitet i närvaro av Vif, men begränsade helt hiv-1 i avsaknad av Vif, och den Vif-resistenta M1-konstruktionen (D128K) begränsade helt hiv-infektion med eller utan Vif (fig. 4a-c). Å andra sidan hade den W127A-innehållande mutanten M9 (med mutationerna F126A/W127A/I187Y, kompletterande figur 9C) som är känd för att störa både RNA-bindning och dimerisering ingen begränsningsaktivitet oavsett Vif-närvaro (fig. 4a-c). Detta stämmer överens med tidigare litteratur som anger att W127 är viktig för hiv:s begränsningsaktivitet på grund av dess RNA-bindningsförmåga som är nödvändig för hA3G-virionförpackning och deamineringsoberoende begränsning av omvänd transkription14,15. Även om dess känslighet för Vif-nedbrytning tycktes vara minskad (kompletterande figur 10A) paketerades ~5- till 10-faldigt mindre M9-mutantprotein i virioner i närvaro eller frånvaro av Vif jämfört med WT hA3G (figur 4a, b). Dessa resultat av WT- och kontrollmutanter M1 och M9 av hA3G visade på full aktivitet eller brist på aktivitet i vår studie.

För mutanterna som utformats för att påverka de intramolekylära CD1-CD2-interaktionerna muterades flera rester nära eller inom interdomängränssnittet på CD2-sidan för M2 och M3 och på CD1-sidan för M4 (kompletterande fig. 9A, B). M2 och M3 hade båda betydligt lägre hiv-1-begränsningsaktivitet i avsaknad av Vif (fig. 4c). M2 med mutationer på CD2-slingor 1 och 3 runt gränssnittet mot CD1 uppvisade en fullständig förlust av katalytisk aktivitet (fig. 4e), sannolikt på grund av att några av dessa muterade rester, t.ex. H216, är viktiga för ssDNA-substratinteraktion49. M3 med mutationer på CD2-gränssnittet mot CD1, med början från länkresterna R194/H195 (kompletterande fig. 9A, B), hade endast ~10 % WT-deaminasaktivitet (fig. 4e), möjligen på grund av förlust av korrekt CD2-interaktion med CD1 för att påverka samordnad ssDNA-substratbindning för effektiv katalytisk aktivitet. M4 som bär på flera mutationer runt interdomängränssnittet på CD1 uppvisade egenskaper som liknar WT, vilket tyder på att dessa mutationer inte har någon uppenbar effekt på begränsningsförmågan. Intressant nog hade denna mutation full katalytisk aktivitet (fig. 4e), vilket tyder på viss plasticitet mellan CD1-CD2-gränssnittsinteraktioner för funktioner.

M12 och M13 utformades för att endast störa RNA-bindningen till PEP-området vid dimerövergången, och M14 innehåller de flesta av mutationerna i M12 och M13 plus fyra ytterligare R/K-rester (K52/K63/R69/K76) för att eliminera den återstående enda positivt laddade ytan på A3G-CD1 (kompletterande fig. 9C). Överraskande nog visade alla dessa mutanter ~70 % hiv-1-begränsningsaktivitet i avsaknad av Vif (fig. 4c). Även om det var svårt att kvantifiera Vif-känsligheten på grund av den ihållande låga uttrycksnivån för M12, M13 och M14 i Vif-känslighetsanalysen (kompletterande fig. 10A) visade alla tre mutanter, i likhet med WT, ingen hiv-begränsningsaktivitet i närvaro av Vif (fig. 4c), vilket tyder på att de i själva verket fortfarande var tillräckligt känsliga för Vif-medierad nedbrytning. Anledningen till att M12-14 endast hade 70 % hiv-1-begränsningsaktivitet berodde inte på deras lägre steady state-proteinnivåer som upptäcktes i HEK293T-celllysat (fig. 4a, b), eftersom transfektion av mindre WT-expressionsplasmid för att uppnå liknande cellulära uttrycksnivåer som M12-M14 fortfarande resulterade i ~4-faldigt mer hiv-1-begränsning än WT (kompletterande fig. 10B). Detta stämmer överens med den deamineringsoberoende begränsningsaktiviteten, eftersom dessa tre mutanter hade störd deamineringsaktivitet (fig. 4d, e). Särskilt M14 hade en fullständig förlust av deaminasaktivitet (fig. 4e). I överensstämmelse med detta var bakgrundsmutationsfrekvensen för M14 baserad på resultaten från sekvenseringen av proviralt DNA (kompletterande tabell 5). Ändå uppvisade den ~70 % hiv-1 restriktionsaktivitet. Dessa resultat visar tydligt att de rester som muterats i M12-14 för att störa RNA-bindningen i PEP och närliggande områden på CD1 endast uppvisade en partiell defekt när det gäller att begränsa hiv, vilket tyder på att de behöll en viss nivå av virionkapsidering och hiv-1-begränsning, vilket står i kontrast till den roll för RNA-bindning som förmedlas genom mutationer som innehåller W127 i M9-mutanten och som är avgörande för virionkapsidering och hiv-begränsning (fig. 4a-c).

De mutanter som är avsedda att störa endast protein-protein-dimerinteraktionerna med ökande antal mutationer är från M6 till M11 (kompletterande tabell 4, kompletterande figur 9C). M6 och M7 uppvisade endast en partiell förlust av begränsningsaktivitet i avsaknad av Vif, trots den 95-procentiga förlusten av katalytisk aktivitet för M7 på grund av de ytterligare tre mutationerna på CD2 (fig. 4e). Därför är mutationerna i M6 och M7 inte kritiska för hiv-begränsning. M10 uppvisade en allvarligare fenotyp vid hiv-1-begränsning i avsaknad av Vif även om den behöll en viss katalytisk aktivitet (fig. 4e), vilket tyder på att mutationer på M10 är viktiga för virionförpackning och hiv-begränsning. M11 liknar M10 när det gäller deaminasaktivitet, men har en mindre allvarlig fenotyp när det gäller begränsningsaktivitet och integration (fig. 4c, d). Det är möjligt att M11 har behållit mer RNA-bindningsförmåga än M10 (från rM10-11 av rA3G-mutantanalysen, fig. 3a-e), vilket resulterar i en mindre allvarlig fenotyp. Sammantaget visade dessa resultat att mutering av rester inom det begravda gränssnittet mellan protein och proteindimer ensamt fortfarande behöll hiv-begränsningsaktiviteten på reducerade nivåer (Fig. 4c), och störningen av deaminasaktiviteten hos dessa mutanter (Fig. 4e) kan delvis förklara minskningen av hiv-begränsningsaktiviteten. Detta står återigen i kontrast till M9-mutanten som inte uppvisade någon hiv-begränsningsaktivitet (fig. 4a-c).