Frontiers in Bioengineeringand Biotechnology

Introduktion

Serumalbuminer är proteiner som vanligen används i biodiagnostik och som modell i forskning om bio-gränssnitt (Rosi och Mirkin, 2005; Singh m.fl, 2005; Arcot et al., 2015). Bland dessa är bovint serumalbumin (BSA) det billigaste och ett protein som ofta används som blockeringsmedel i ELISA-tester (Maingonnat et al., 1999). I pappersdiagnostik ökar BSA (Huang et al., 2018) selektivt papperets hydrofobicitet för att förbättra flödet av biovätskor och eluering genom att minska vätskeabsorptionen. BSA skyddar och ökar livslängden för funktionella biomolekyler som torkats på papper. Funktionaliteten och livslängden hos immunoglobin G och immunoglobin M som torkats på BSA-behandlade ytor kan öka med en storleksordning (van Remoortere et al., 2001). BSA förhindrar också ospecifik adsorption av analytiska proteiner för kvantitativ analys.

Flera artiklar har utförligt rapporterat om BSA-molekylers sorptionsfenomen vid olika gränsytor såsom guld (Dennison et al., 2017), glimmer (Fitzpatrick et al., 1992), kisel (Jachimska et al., 2016; Givens et al., 2017) och cellulosa (Mohan et al., 2014; Lombardo et al., 2017). Den adsorberade BSA-molekylens konformation och topologin hos det bildade skiktet påverkas starkt av pH, jonstyrka och temperatur. BSA-molekyler behåller sin nativa struktur mellan pH 4,0 och 8,0. Under pH 4,0 och över 8,0 ändrar BSA-molekylerna sin vikningskonformation som skiljer sig från deras nativa struktur (Su et al., 1998a; Barbosa et al., 2010; Phan et al., 2015). Den isoelektriska punkten för BSA ligger vid pH 4,5. Vid detta pH blir nettoyteladdningen noll och BSA-molekylerna aggregerar. Ökat pH ökar BSA-laddningen och den dominerande elektrostatiska repulsionen stabiliserar BSA-molekylerna och förhindrar aggregering (Li et al., 2008).

Trots att det är ett av de mest studerade proteinerna kvarstår flera frågor om vilken effekt pH och jonstyrka har på BSA-konformationen vid adsorption. I detta sammanhang saknar begreppet yttäckning, som enbart definieras av ytfraktion eller vikttäthet, klarhet. Det finns ett behov av att bättre förstå de variabler som definierar gränssnittet mellan fast och flytande BSA för att konstruera robusta bio-diagnostiska anordningar.

Bovin serumalbuminmolekyler adsorberas vid ett gränssnitt och bildar ett skikt med en tjocklek på nanometerskala. Några få karakteriseringsmetoder som reflektivitet (Su et al., 1998b, 2016; Raghuwanshi et al., 2017a, b), ellipsometer, atomkraftmikroskop (AFM), ytplasmonresonans (SPR) och kvartskristallmikrobalans med dissipation (QCM-D) kan mäta det adsorberade proteinskiktets tjocklek i den nanometerskala som krävs. I synnerhet kan QCM-D kinetiskt övervaka sorptionsprocessen av biomolekyler genom att mäta den adsorberade proteinmassan vid ett gränssnitt i nanogram (Kristensen et al., 2013; Luan et al., 2017). QCM-D möjliggör kontroll av temperatur, jonstyrka och pH-miljö. Dissipationsläget i QCM avslöjar styvheten hos de adsorberade proteinlagren.

I den här studien beskrivs ett reversibelt pH-responsivt beteende hos BSA-molekyler som adsorberas vid gränssnittet mellan guld och saltlösning. Det adsorberade BSA-skiktet beter sig som en pH-känslig svamp där vattenmolekylerna adsorberas och desorberas beroende på det omgivande pH-värdet mellan 4 och 8. Detta arbete övervakar och kvantifierar vattensorptionsfenomenet i BSA-svampliknande skikt och belyser de mekanismer som är inblandade vid olika pH-värden och jonstyrkor. Vårt mål är att beskriva BSA-täckningen vid gränsytan mellan fast och flytande substans i termer av antal molekyler och skiktets vikt/tjocklek. Detta för att klargöra begreppet yttäckning av biomolekyler och för att belysa det dynamiska beteendet hos adsorberade BSA-molekyler i samband med biodiagnostik.

Material och experiment

Material

Bovint serumalbumin i lyofiliserat pulver (97 %) och natriumklorid (NaCl) salt (99,5 %) köptes från Sigma Aldrich (Castle Hill, NSW, Australien). Saltsyra (HCl) och natriumhydroxid (NaOH) köptes från Merck Ltd. Alla kemikalier är av analytisk kvalitet och användes utan någon rening.

QCM-D-mätningar

Mätningar av kvartskristallmikrobalansen med dissipationsmätningar utfördes på ett E4-QCM-D-instrument från Biolin Scientific Ltd. Guldbelagda kvartskristallsensorer användes efter rengöring i en H2O2:NH3:H2O-lösning (1:5:5) i 15 minuter och efterföljande UV-Ozonrengöring i 10 minuter.

Guldsensorerna placerades i flytande cellmoduler. 1 mg/mL BSA löstes upp i saltlösning (0,9 % NaCl) och lösningens pH ställdes in på pH 7,0 och 4,5. Separat justerades saltlösningens pH till 7,0 och 4,5. De beredda lösningarna passerade genom vätskecellsmodulerna med hjälp av en peristaltisk pump. Förändringar i kvartssensorns resonansfrekvens (F) och dissipation (D) med avseende på grundfrekvensen 5 MHz och sex olika udda övertoner (1, 3, 5, 7, 9 och 13) övervakades samtidigt.

Först pumpades en koksaltlösning in i vätskekällan och fick jämna ut sig för att generera en stabil baslinje. Därefter passerade BSA i saltlösning genom cellen och lät BSA-molekylerna adsorbera vid guldgränssnittet. Därefter pumpades saltlösning för att avlägsna alla BSA-molekyler som inte var fastbundna. Sköljningscykler av saltlösningar med olika pH och vatten gjordes sedan enligt följande:

De erhållna variationerna i resonansfrekvensen ΔF och dissipationen ΔD anpassades med Sauerbrey-modellen med hjälp av programvaran Dfind.

DLS-mätningar

Dynamisk ljusspridning (DLS) på BSA dispergerad i saltlösning vid olika pH (4,5 och 7,0) mättes på DLS-partikelstorleksanalysator (Brookhaven Nanobrook Omni). En källa med 40 mW (640 nm) temperaturkontrollerad röd halvledarlaser användes. Mätningarna utfördes tre gånger och medelvärdet beräknades. Alla mätningar utfördes vid rumstemperatur (22 °C).

Kontaktvinkelmätningar

Kontaktvinkeln på guld och BSA adsorberad vid olika pH på ett guldgränssnitt mättes med hjälp av en uppställning OCA 35 DataPhysics Instruments GmbH, Tyskland. Mätningarna utfördes direkt på sensorytan som togs ut ur QCM-uppställningen efter mätningen. Alla mätningar utfördes vid rumstemperatur (22 °C). Minst fem kontaktvinkelmätningar utfördes på sensorytan och medelvärdet beräknades.

Atomkraftmikroskop (AFM)

Atomkraftmikroskopiska mätningar utfördes i tappningsläge med en JPK Nanowizard III AFM. De cantilevers (AC160TS-R3) som valdes för avbildning hade en nominell frekvens på 300 kHz och en fjäderkonstant på 26 N/m. Avbildningen utfördes på det nakna guldgränssnittet och det adsorberade BSA-skiktet vid pH 4,5 vid guldgränssnittet. Bilderna togs direkt på sensorytan som togs ut ur QCM-uppställningen efter mätningen. Alla mätningar utfördes vid rumstemperatur (22 °C).

Resultat

Ett reversibelt pH-responsivt vattensorptionsfenomen för BSA-molekyler som adsorberats vid gränsytan mellan fast och flytande material studeras med QCM-D med sköljcykler av saltlösning vid pH 7,0 och 4,5. Guld valdes som fast gränssnitt eftersom dess hydrofobicitet styr BSA-adsorptionen (Lori och Hanawa, 2004; Phan et al., 2015; Ozboyaci et al., 2016). BSA-skikten som adsorberats vid olika pH-värden sköljs med omväxlande cykler av saltlösningar vid pH 4,5 och 7,0. Dessutom genomfördes sköljning med rent Milli-Q vatten för att utvärdera vilken effekt jonstyrkan har på det adsorberade BSA-skiktet.

Figur 1 (överst) visar förändringen av frekvensen (F5 och F7) för BSA-molekylerna som adsorberats vid pH 7,0 från BSA/saltlösning följt av sköljning med den ursprungliga saltlösningen (pH 7). Nästa sköljcykel utfördes med saltlösning med pH 4,5. Därefter följer omväxlande cykler med saltlösningar vid pH 4,5 och 7.

I figur 1 observerades en plötslig minskning av F efter ett inledande stabilt utgångsvärde, vilket indikerar adsorption av BSA-molekyler vid gränsytan mellan guld och vätska. F minskade upp till ΔF = -35,5 och stabiliserades sedan. Vid sköljning med saltlösning (pH 7) ökade F från ΔF = -35,5 till ΔF = -34,0, vilket visar att de icke-adsorberade BSA-molekylerna avlägsnas från ytan. Efter sköljning med saltlösning (pH 4,5) ökade F ytterligare till ΔF = -30,0, vilket visar att ytterligare massa försvinner från sensorytan. Överraskande nog minskade F till ΔF = -34,0 vid senare sköljning med saltlösning (pH 7,0), vilket innebär en ökning av massan på sensorytan på grund av att vattenmolekylerna absorberas i BSA-skiktet. Efterföljande sköljcykler med saltlösning följer samma cykliska massförändring vid guldgränssnittet.

I det andra experimentet, som liknar det första experimentet, följdes adsorption av BSA-molekyler vid pH 4,5 av sköljcykler med saltlösning vid olika pH-värden (figur 1: nedre delen). De adsorberade BSA-molekylerna motsvarar minskningen av F till ΔF = -38,5. Sköljning med saltlösning (pH 4,5) avlägsnar den icke-adsorberade BSA (ΔF = -38,0).

Efter sköljning med saltlösning (pH 7,0) ökar massan av skiktet på guldytan ytterligare, vilket motsvarar minskningen av F till ΔF = -43. Ökningen av massan beror på absorptionen av vattenmolekyler i BSA-skiktet. Senare sköljning med saltlösning (pH 4,5) desorberar vattenmolekyler och ger tillbaka F-värdet till ΔF = -37. Varje sköljcykel adsorberar och desorberar samma mängd vattenmolekyler.

I samma experiment studerades effekten av jonstyrka på det adsorberade BSA-skiktet genom att skölja skiktet med rent vatten. Figur 1 visar BSA-adsorptionen vid pH 7,0 och 4,5 följt av sköljcykler med saltlösning vid olika pH och med rent Milli-Q-vatten.

I båda fallen ökar sköljning med vatten värdet i ΔF = -29,2 (BSA adsorberat vid pH 4,5) och -26,5 (BSA adsorberat vid pH 7,0). Detta tyder på att sköljning med vatten ytterligare minskar massan, vilket motsvarar ytterligare desorption av vattenmolekyler från gränssnittet. Varje sköljcykel upprätthåller samma beteende i massförändringen, vilket beror på vattensorptionen i BSA-skiktet.

Interessant nog visar alternerande sköljcykler med saltlösning vid pH 4,5 och 7,0 i alla experiment den reversibla sorptionen av vattenmolekyler i det adsorberade BSA-skiktet. Sköljning av BSA-skiktet med saltlösning vid pH 7,0 adsorberar vattenmolekyler i BSA-skiktets struktur, vilket ökar massan i gränsytan mellan fast och flytande substans. Sköljning av BSA-skiktet med saltlösning vid pH 4,5 däremot desorberar vattenmolekyler från BSA-skiktet, vilket minskar gränssnittets massa. Den helt reversibla vattensorption som uppmätts tyder på att BSA-molekylerna inte desorberas under sköljningen och att deras yttäckning förblir identisk; endast antalet vattenmolekyler i interfasen varierar.

Fenomenet med vattensorption vid sköljning med saltlösning (vid olika pH-värden) uppträder endast på grund av det adsorberade BSA-skiktet och bekräftas av ett separat försök med sköljning med saltlösning på den obehandlade guldsensorn (supplementärmaterial S1). En stabil baslinje för den nakna guldsensorns frekvens upprätthålls av saltlösningen (vid pH 4,5). Därefter sköljdes guldgränssnittet med alternativa saltlösningsspolningscykler med pH 7,0 och 4,5 (kompletterande material S1). Resultaten visar tydligt att den alternativa sköljningen med saltlösning vid olika pH-värden inte har någon effekt på guldsensorfrekvensen. Därför är det endast det adsorberade BSA-skiktet på guldet som uppvisar frekvensförändringen vid saltlösningsspolningscykler vid olika pH-värden.

Den adsorberade massan, yttäckningen och tjockleken på det adsorberade BSA-skiktet extraheras genom att Sauerbrey-modellen anpassas till QCM-data. Modellen används för att anpassa ett styvt lager där dissipationsvärdet är mindre än 2, vilket observerades i alla våra experiment (Supplementary Material S2). Sauerbrey-ekvationen ges av Δm=-CΔfn, där C = 17,7 ng/Hz.cm2 är konstant för den 5 MHz guldbelagda kvartskristallen, n är övertonen, Δm är den adsorberade massan och Δf är förändringen av frekvensen.

BSA-molekylerna adsorberades upp till en masstäckning på 6,3 mg/m2 (tjocklek 5,6 nm) vid pH 7,0 (figur 2A). Sköljning av för adsorberat BSA-skikt med saltlösning (pH 4,5) minskade masstäckningen till 5,6 mg/m2 och tjockleken till 4,9 nm (tabell 1), vilket beror på att vattenmolekyler frigörs från den adsorberade BSA-skiktstrukturen. Ytterligare sköljning med saltlösning (pH 7,0) adsorberar återigen vattenmolekyler i samma mängd. Skillnaden i massförändring är Δm = 0,7 mg/m2.

Samma sak i figur 2B, sköljning av det för-adsorberade BSA-skiktet vid pH 4,5 med koksaltlösning (vid pH 7,0) ökar den adsorberade massan från 6,4 mg/m2 till 7,4 mg/m2 och tjockleken från 6,2 till 6,9 nm, vilket beror på vattenmolekylers absorption i BSA-skiktet. Sköljcykeln med saltlösning vid olika pH-värden höll skillnaden i massförändring Δm = 1,0 mg/m2 som är 1,4 gånger högre än massförändringen vid pH 7,0 (0,7 mg/m2).

Det genomsnittliga antalet vattenmolekyler som adsorberas/desorberas i BSA-skiktet under sköljcykeln med saltlösning beräknas från skillnaden i adsorberad massa vid olika pH-värden (Supplementary Material S3). BSA-skiktet som adsorberas vid pH 4,5 adsorberar/desorberar 3,3 × 1019 vattenmolekyler under sköljcyklerna, vilket motsvarar 570 vattenmolekyler/BSA-molekyl (tabell 1). BSA-skiktet som adsorberas vid pH 7,0 adsorberar/desorberar dock 2,3 × 1019 vattenmolekyler, eller 450 vattenmolekyler/BSA-molekyl, under den reversibla sköljcykeln med saltlösning.

Mätningar av dynamisk ljusspridning (DLS) klargör BSA:s aggregerade och icke-aggregerade tillstånd i saltlösning vid pH 4,5 och pH 7,0 (figur 3). Vid pH 4,5 visar DLS att BSA-molekylerna aggregerar och uppvisar flera storleksfördelningar: 5 nm, 10 nm, 20 nm och 50 nm. Vid pH 7,0 aggregerar BSA-molekylerna dock inte på grund av elektrostatisk repulsion och har en storleksfördelning på 5 och 10 nm. Storleken på 5 och 10 nm hos hydrerad BSA är jämförbar med storleken och formen hos enskilda BSA-molekyler (14 nm × 4 nm × 4 nm) (Anderegg et al., 1955; Wright och Thompson, 1975).

Atomkraftmikroskopbilder bekräftar adsorptionen av BSA-molekylen vid guldgränssnittet (figur 4). Bilderna visar skillnader i ytmorfologin hos blankt guld (figurerna 4a och b) och BSA som adsorberats vid guldgränssnittet vid pH 4,5 (figurerna 4c och d). Vid jämförelse av de förstorade bilderna av det nakna guldet (figur 4b) och den BSA-absorberade ytan (figur 4d) är skillnaderna mellan ytorna märkbara. Även om båda ytorna har partiklar som bildar dem, är definitionen och därmed det material som avbildas olika. Partiklarna på den nakna guldytan är mer definierade (t.ex. skarpare gränser mellan formerna), vilket tyder på ett hårdare material jämfört med den BSA-belagda ytan. Det BSA-belagda guldet visar förekomsten av ytterligare aggregat av BSA-molekyler. Den förstorade AFM-bilden av BSA-belagt guld (figur 4d) visar att den laterala dimensionen av de aggregerade BSA-molekylerna varierar mellan 30 och 100 nm med en höjd i intervallet 5-15 nm.

Kontaktvinkeln som bildas av vattendroppar på två ytor: guld och BSA som adsorberats på guld mättes för att klargöra vätbarheten (figur 5). Guldsensorn är hydrofil med en kontaktvinkel på 66°. BSA-skiktet som adsorberats vid pH 4,5 blir dock mer hydrofilt då vattenkontaktvinkeln minskade till 60°, vilket ytterligare minskade till 55° för BSA-skiktet som adsorberats vid pH 7,0. En liknande observation rapporterades för BSA-skikt adsorberade på en kiselyta då vattenkontaktvinkeln minskade från 57° (vid pH 4,5) till 54° (vid pH 7,0) (Jachimska et al., 2016). Förändring i kontaktvinkel och skikttjocklek för BSA som adsorberats vid olika pH tyder på strukturella och topografiska skillnader under adsorptionsprocessen vid guldgränssnittet.

Diskussion

Den isoelektriska punkten för BSA ligger mellan pH 4,5 och 4,8; det är det pH vid vilket molekylens nettoladdning blir noll. Nära den isoelektriska punkten har BSA-molekylerna mindre elektrostatisk repulsion mellan molekylerna. Den höga jonstyrkan i saltlösning (0,15 M) spelar också en roll när det gäller att avskärma laddningar och hindra elektrostatiska interaktioner. Därför aggregerar BSA-molekylerna i suspensionen av BSA och saltlösning. DLS-mätningar (figur 3A) bekräftar förekomsten av BSA-aggregat med en storlek på upp till 60 nm i BSA/saltsuspensionen vid pH 4,5.

Under BSA-adsorptionen (vid pH 4,5) vid guldgränssnittet förväntas ingen elektrostatisk attraktion av BSA mot guldgränssnittet. En svag positiv laddning från det globulära BSA-proteinet kan dock ge en tillräcklig drift för adsorption vid ett gränssnitt (Su et al., 1998a; Jachimska et al., 2016). Flera artiklar har tidigare rapporterat att adsorptionen av BSA och liknande proteiner nära den isoelektriska punkten drivs av hydrofoba interaktioner som väger tyngre än de elektrostatiska interaktionerna (Uyen et al., 1990; Tilton et al., 1991; Figueira och Jones, 2008; Norde, 2008; Jeyachandran et al., 2009; Rabe et al., 2011; Huang et al., 2017; Xu et al., 2018; Attwood et al., 2019). Kontaktvinkelmätningarna (figur 5) visar att det nakna guldgränssnittet är mindre hydrofobt, och albumin binds till guldet via hydrofoba interaktioner (Norde och Giacomelli, 2000; Figueira och Jones, 2008). Eftersom repulsionerna mellan BSA-molekylerna är avskärmade adsorberar de hydrerade BSA-molekylerna i stora mängder (6,4 mg/m2 ) som aggregat och med flera kontaktpunkter på guldgränssnittet (figur 6A). AFM-bilden (figurerna 4c och 4d) bekräftar adsorptionen och aggregeringen av BSA-molekyler vid guldgränssnittet. AFM-bilderna visar att den laterala dimensionen hos aggregaten varierar mellan 30 och 100 nm och att höjden är fördelad mellan 5 och 15 nm. Detta bekräftar att BSA-molekylerna adsorberas som en kombination av både stående och platta konformationer.

Vid pH 7,0 är BSA-molekylerna negativt laddade. Detta skapar en elektrostatisk repulsion mellan BSA-molekylerna som hindrar BSA-agglomerering i lösning. DLS-mätningar visar fördelningen av icke-aggregerade BSA-molekyler av storleken 5 och 10 nm (figur 3B). Dessa storlekar är jämförbara med dimensionerna hos enskilda BSA-molekyler (14 nm × 4 nm × 4 nm) (Anderegg et al., 1955; Wright och Thompson, 1975). Vid adsorption av BSA på guld bildar en kombination av både elektrostatisk avstötning och hydrofoba interaktioner ett BSA-skikt vid gränssnittet. Den starka laterala intermolekylära repulsionen mellan de adsorberade BSA-molekylerna minskar BSA-adsorptionskapaciteten (5,6 mg/m2 ) vid gränssnittet. Därför adsorberas BSA-molekylerna som enskilda molekyler (inte aggregat) och bildar ett monolager vid guldgränssnittet (figur 6A).

I QCM-D-experimenten (figur 1) adsorberas förhydrade BSA-molekyler vid gränssnittet. Vid alternativa sköljningar med saltlösning vid olika pH adsorberar/desorberar BSA-skiktet ytterligare vattenmolekyler. BSA-molekyler som adsorberats vid pH 4,5 fångar in och släpper ut fler vattenmolekyler (1,0 mg/m2) jämfört med BSA-molekyler som adsorberats vid pH 7,0 (0,7 mg/m2). Orsaken är att mängden BSA som adsorberas vid pH 4,5 (6,4 mg/m2) är större än vid pH 7,0 (5,6 mg/m2).

Den beräknade torrmassan (icke hydratiserad) av BSA-molekylerna som adsorberas för en fullständig yttäckning av guldsensorn är cirka 2 mg/m2 (Supplementary Material S3). Den beräknade torrmassan är jämförbar med den rapporterade litteraturen (Jachimska et al., 2016). När en torr BSA-molekyl hydreras binds dess hydrofila grupper snabbt till vatten. Bindningen beror på vattnets dipolära struktur som interagerar med de polära grupperna i BSA. I hydrerad BSA är vissa vattenmolekyler fast bundna, medan andra vattenmolekyler är löst bundna eller helt enkelt är instängda mellan BSA:s loopstruktur. Mängden vatten som hydrerar BSA-skiktet ökar den adsorberade massfraktionen vid gränssnittet. I saltlösningen leder sköljcykeln vid olika pH-värden till en omfördelning av laddningar på det adsorberade BSA-skiktet. Denna omfördelning av laddningar skapar en gradient mellan det adsorberade BSA-skiktet och bulklösningen. Gradienten fungerar som en drivkraft för att fånga in och frigöra löst bundna vattenmolekyler från BSA-skiktet.

Tjockleken på BSA-skiktet utvärderas genom att anpassa Sauerbrey-modellen till QCM-D-data (figur 2). Det hydrerade BSA-skiktet som adsorberats vid pH 4,5 och sköljts med saltlösning (pH 7,0) ger den större tjockleken på 6,9 nm (figur 6B). Den stora mängden adsorberade BSA-molekyler (6,4 mg/m2) fångar in många vattenmolekyler som sväller BSA-skiktet. Sköljning av samma skikt med saltlösning (pH 4,5) minskar skiktets tjocklek till 6,4 nm, vilket beror på att vattenmolekyler frigörs från skiktet. Ett liknande fenomen observeras för BSA-molekyler som adsorberats vid pH 7,0. BSA-skiktets tjocklek är dock tunnare än för det BSA-skikt som adsorberats vid pH 4,5 (figur 6B).

Det adsorberade BSA-skiktet vid båda pH-värdena förblir dessutom styvt och irreversibelt fäst under saltlösningens sköljcykler. Endast sorption av vattenmolekyler sker under pH-variationen. Den adsorberade BSA:s styvhet och irreversibilitet beror på BSA:s stora storlek och höga molekylvikt. BSA-molekylen bildar en mängd kontaktpunkter vid gränssnittet mellan guld och vätska genom elektrostatiska och hydrofoba interaktioner som förhindrar desorption av BSA-molekyler från gränssnittet.

BSA-skiktet lossnar inte från guldgränssnittet, inte ens vid förändringar i lösningens jonstyrka (sköljning med avjoniserat vatten). Sköljning med vatten desorberar bara fler vattenmolekyler från BSA-skiktet och massan på sensorytan minskar ytterligare (figur 2). Om man ändrar jonstyrkan hos hydrerad BSA med rent vatten frigörs fler vattenmolekyler från skiktet. BSA-skiktet krymper till en tjocklek på 4,8 nm (när det adsorberas vid pH 4,5) och 4,3 nm (när det adsorberas vid pH 7,0) enligt figur 6B. Fortsatta sköljcykler med saltlösning ger samma reversibla vattensorptionsfenomen.

Slutsats

Bovin serumalbumin i saltlösning (0,9 % NaCl) adsorberades vid gränssnittet mellan guld och vätska vid pH 7,0 och 4,5. Den dynamiska processen mättes med QCM-D och bekräftades med AFM, DLS och kontaktvinkelmätningar. Ett reversibelt, snabbt och pH-beroende vattensorptionsfenomen observeras för det adsorberade BSA-skiktet genom att utföra sköljcykler med saltlösning vid pH 4,5 och 7,0. Vattenmolekylerna hydrerar BSA-skiktet vid pH 7,0 och dehydrerar det vid pH 4,5. Det BSA-skikt som adsorberats vid pH 4,5 hydreras av 1,4 gånger fler vattenmolekyler än det BSA-skikt som adsorberats vid pH 7,0. Detta fenomen förklaras av att BSA-molekyler som adsorberas vid olika pH-värden har olika konformationer. Nära den isoelektriska punkten vid pH 4,5 neutraliseras BSA-molekylerna och adsorberas som aggregat i stora mängder: 6,4 mg/m2. Vid pH 7,0 blir BSA-molekylerna laddade (elektrostatisk repulsion) och adsorberas som ett lager av enskilda molekyler (5,6 mg/m2). Skiktet av aggregerade BSA-molekyler (vid pH 4,5) som adsorberas vid guldgränssnittet fångar in fler vattenmolekyler (570 vattenmolekyler/BSA) än skiktet av enskilda BSA-molekyler (vid pH 7,0), som behåller 450 vattenmolekyler/BSA. Att ändra jonstyrkan genom att skölja BSA-skiktet med rent vatten innebär endast att mer vatten avlägsnas från den adsorberade skiktstrukturen. I alla fall är BSA-skiktet stelt och irreversibelt adsorberat på guldgränssnittet och endast vattenmolekylerna adsorberas/desorberas under sköljningscykeln. Det observerade fenomenet är viktigt för den grundläggande förståelsen och för att konstruera nya bio-diagnostiska anordningar och robusta sensorer.

Data Availability Statement

Rådata som stödjer slutsatserna i denna artikel kommer att göras tillgängliga av författarna, utan onödiga reservationer, för alla kvalificerade forskare.

Författarnas bidrag

VR, CB och BY utförde experimenten. VR och GG utförde dataanalysen och skrev manuskriptet.

Finansiering

Detta arbete stöddes av Australian Research Council (ARC), Australian paper, Norske Skog, Orora och Visy genom Industry Transformation Research Hub grant IH170100020.

Intressekonflikt

Författarna förklarar att forskningen har utförts i avsaknad av kommersiella eller finansiella relationer som skulle kunna tolkas som en potentiell intressekonflikt.

Supplementärt material

.