Frontiers in Pharmacology

Introduktion

Biologiskt aktiva peptider är den allmänna termen för olika peptider som utgörs av olika sammansättningar och arrangemang av naturliga aminosyror. De är kända för att ha en mängd olika biologiska funktioner som antioxidant, immunfrämjande, hormonmodulerande, antibakteriell, antitrombotisk, antiviral och antihypertensiv verksamhet på grund av multifunktionella föreningar som härstammar från animaliska eller vegetabiliska proteiner (Wang et al., 2017). Dessutom har de hög livsmedelssäkerhet och hög biotillgänglighet vilket gör dem till potentiella kandidater för utveckling av funktionella peptidläkemedel och funktionella livsmedelstillsatser (Sarmadia och Ismaila, 2010).

Enligt Världshälsoorganisationens uppskattning står CVD för dödligheten hos mer än 17,5 miljoner människor varje år. Bland de viktiga egenskaperna hos CVD är hypertoni ett viktigt mål för förebyggande och behandling av CVD (Celermajer et al., 2012). De blodtryckssänkande läkemedel som för närvarande används, t.ex. captopril och enalapril, är begränsade i sin användning på grund av biverkningar som hosta, utslag och huvudvärk (Yu et al., 2018). De ständigt ökande förekomsterna av CVD kräver dock några nya och säkra alternativ såsom livsmedelsbaserade aktiva peptider. På senare tid har betydande framsteg gjorts när det gäller identifiering och screening av livsmedelskomponenter som positivt påverkar den kardiovaskulära hälsan (Martinez-Maqueda et al., 2012; Liu et al., 2018). Bland sådana föreningar har peptider fått särskild uppmärksamhet på grund av deras antihypertensiva effekt. Tidigare har den hypotensiva aktiviteten in vitro hos peptider främst bestämts genom att mäta den hämmande aktiviteten hos angiotensinkonverterande enzym (ACE) som är ett dipeptidylkarboxypeptidas som är lokaliserat på cellmembranet och som kan orsaka stora skador genom att störa balansen mellan de två hormonsystemen som reglerar blodtrycket och vätskebalansen (Clayton et al., 2015; Gebre et al., 2018). Dessutom bekräftades livsmedelsbaserade antihypertensiva peptider som utövar en hypotensiv effekt på hypertensiva patienter utan någon toxicitet eller biverkningar (Martinez-Maqueda et al., 2012). Separering och rening av antihypertensiva peptider från livsmedelsproteiner skulle ge en ny riktning för utveckling av naturliga antihypertensiva läkemedel.

Ginkgo biloba fröresurser har studerats i stor utsträckning över hela världen på grund av deras anmärkningsvärda biologiska aktivitet och farmakologiska verkan. Ginkgofrö, som traditionell kinesisk medicin, har en mer än 600-årig historia, men man vet inte mycket om dess viktigaste aktiva komponenter. Endast ett fåtal studier har rapporterat de antioxidativa, antitrötthetsskapande och bakteriostatiska effekterna av proteinisolat av G. biloba-frön (Lena och Philip, 2002; Huang et al., 2010). Wu et al. (2013) hydrolyserade Ginkgo peptid med alkalas och pepsin för att erhålla två antioxidativa peptider med en förmåga att fånga upp fria radikaler och hämma lipidperoxidation. Ginkgo hypotensiva peptider måste dock utforskas ytterligare för att avslöja deras underliggande mekanismer för högre verkan.

Här använde vi fyra typer av proteaser för att hydrolysa GPI, för att välja ett av hydrolyserna med hög ACE-hämmande aktivitet och utföra ultrafiltrering för att erhålla komponenter med olika MWs. Effekterna av MWs på den ACE-hämmande aktiviteten hos GPHs undersöktes. Dessutom fastställdes sambandet mellan aminosyrasammansättning och peptidaktivitet. De nyligen extraherade ACE-hämmande peptiderna renades, identifierades och syntetiserades; deras IC50-värden testades och peptidhämmningsmönster med hjälp av Lineweaver-Burk-plottar undersöktes. Vi belyste också ACE-hämmningsmekanismen med hjälp av molekylär dockningsanalys.

Material och metoder

Material

G. biloba L. frön köptes från Linyi stad i Shandongprovinsen, Kina. Fröna skalades, skalades och användes för vidare experiment. Angiotensin I-konverterande enzym och hippuryl-l-histidyl-L-leucin (HHL), hippurinsyra köptes från Sigma (St. Louis, MO, USA) respektive Yuanye Bio-Technology (Shanghai, Kina). Captopril anskaffades från MedChem Express (NJ, USA).

Förberedelse av GPI

G. biloba L. frön torkades vid 45°C, krossades sedan till pulver och siktades genom 80 mesh. Pulvret frystorkades efter avfenolering och avfettningsbehandling. Det resulterande pulvret av G. biloba frön löstes upp i DW (1:20, w/v; pH 10,0). Suspensionen rördes och extraherades i 12 timmar följt av centrifugering vid 10 000 g i 30 minuter. Den erhållna supernatanten ställdes in till den isoelektriska punkten för ginkgoprotein pH 4,62 och inkuberades i 60 minuter följt av ytterligare centrifugering vid 10 000 g i 30 minuter. Den erhållna fällningen resuspenderades med destillerat vatten och lösningen justerades till pH 7. Därefter frystorkades de erhållna GPI:erna fram till nästa användning.

Förberedelse av Ginkgoproteinhydrolysat (GPHs)

För detta framställdes 4 % GPI-lösning som hydrolyserades separat med fyra proteaser vid deras optimala hydrolysvillkor under 5 timmar. Enzymdoserna var 2 000 U. Efter hydrolysen inaktiverades enzymerna vid 90 °C i 10 minuter och lösningen centrifugerades vid 3 000 g i 30 minuter för att erhålla de enskilda supernatanterna som erhållits från fyra enzymer.

Hydrolysegrad

Hydrolysegraden (DH) beräknades med hänvisning till metoden av Kimatu et al. (2017) enligt följande:

där B representerade mängden (mL) NaOH som tillsattes för att hålla pH konstant under hydrolysprocessen; Nb var den molära koncentrationen av NaOH-lösningen; MP var massan (g) av proteinet; α betecknade den genomsnittliga dissocieringsgraden i proteinsubstratet under hydrolysen; htot var det totala antalet peptidbindningar i proteinet.

Isolering och rening av ACE-hämmande peptid

Provets ultrafiltrering utfördes med hjälp av MSC300 ultrafilter av skåltyp (MoSu, Shanghai, Kina). Provet tillsattes från matningsporten och kväveflaskan kopplades till ultrafiltreringskoppens slangkoppling. Därefter placerades och packades den ultrafiltrerade koppen på magnetomröraren som var ansluten till kvävgasflaskan med ett tryck på högst 0,22 MPa. Proverna passerade sekventiellt genom ultrafiltreringsmembran med 1, 3, 5 och 10 kDa och fyra komponenter erhölls (<1, 1-3, 3-5 och 5-10 kDa). De fyra fraktionerna samlades upp, frystorkades och användes sedan för att testa den ACE-hämmande aktiviteten. Komponenterna med högre ACE-aktivitet valdes ut för ytterligare rening enligt det förfarande som anges av Zheng et al. (2017). Det frystorkade hydrolyzat (200 mg) som erhållits efter ultrafiltrering resuspenderades i renat vatten för att erhålla en slutkoncentration på 50 mg/ml och utsattes för ytterligare rening med hjälp av Sephadex G-15 gelfiltreringskolonn (1,5 cm × 60 cm). Proverna filtrerades med ett mikrofiltreringsmembran och eluering utfördes med destillerat vatten med en flödeshastighet på 1 ml/min. Provet övervakades och separerades vid en våglängd på 220 nm med hjälp av P270 semi-preparativ HPLC (Aixin, Guangzhou, Kina). Fraktioner (7,5 mL vardera) samlades upp och frystorkades.

Bestämning av ACE-hämmande aktivitet

Detta test utfördes enligt beskrivningarna ges i den tidigare rapporten av O’Loughlin et al. (2014) med vissa ändringar. Kortfattat blandades substratet hippuryl-histidyl-leucin (HHL, 5 mM) och proverna i 0,1 M Na2 (pH 8,3) med 0,3 M natriumklorid. Därefter tillsattes 50 μL av provet och 150 μL av substratet till ett centrifugeringsrör, blandades och fick stå i vatten vid 37 °C i 5 minuter. Därefter tillsattes ACE-lösningen (50 mU/mL) och inkuberades vid 37 °C i 45 min. Reaktionen avslutades genom att 250 μl 1M HCl tillsattes och lösningen filtrerades genom 0,45 μM nylon sprutfilter innan den analyserades med RP-HPLC (Waters, Milford, MA, USA) på en Inertsil ODS-3 (250 × 4,6 mm, 5 μm partikelstorlek). Den rörliga fasen bestod av destillerat vatten: acetonitril = 75:25 (V/V, med 0,1 % TFA) med en flödeshastighet på 0,5 mL/min och detektion vid 228 nm. Captopril användes som kontroll och den hämmande aktiviteten (%) bestämdes enligt nedan:

där A var toppområdet för hippurinsyra med provet, B var utan provet.

LC-MS/MS-analys och identifiering av renade peptidsekvenser

De renade proverna analyserades med Q Exactive (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) med hjälp av en Easy-nLC 1000 (Thermo Fisher Scientific, MA, USA). Provet avsaltades och lyofiliserades, rekonstituerades i 0,1 % FA-lösning och förvarades vid -20 °C fram till nästa användning. De två rörliga faserna var följande: rörlig fas A utgjordes av en vattenlösning av 0,1 % myrsyra, och rörlig fas B var en vattenlösning av 0,1 % myrsyra och acetonitril (acetonitril var 84 %). Efter jämviktning av kolonnen med 95 % av A-lösningen laddades provet från autosamplaren till Trap-kolonnen. Förhållandet mellan massa och laddning för peptidfragmenten samlades in på följande sätt: totalt 20 fragmentmönster förvärvades efter varje fullständig skanning. Den råa masspektrometritestfilen genomsöktes med hjälp av programvaran Mascot 2.2 för motsvarande databas.

Syntes av peptider

Potentiella ACE-hämmande peptider som identifierats med LC-MS/MS syntetiserades hos GL Biochem (Shanghai, Kina). Renheten hos de syntetiska peptiderna bekräftades ytterligare med HPLC som var större än 95 %.

Kinetik för ACE-hämning

Den kinetiska hämmningsmodellen för G. biloba-peptid testades med hjälp av metoden från Lin et al. (2017). Kortfattat lät man olika koncentrationer av substratet HHL (0,5, 1, 2 och 5 mM) reagera med ACE. Lineweaver-Burk-plotten baserades på reciproken av reaktionshastigheten (1/v) och substratkoncentrationen (1/). Intercepten på X- och Y-axeln representerade reciprokerna av Km respektive Vmax.

Dockinganalys

För detta hämtades den tredimensionella strukturfilen för ACE-proteinet (PDB ID: 1O8A) från RCSB Protein Data Bank (PDB1). Den tredimensionella strukturen för G. biloba-peptiderna ritades med hjälp av molekylarsimuleringsprogrammet Discovery Studio 3.5. Hydrobearbetningen utfördes och energin minimerades med CHARMM-programmet. Dessutom behölls Zn2+ i ACE-modellen. Programvaran DS 3.5 poängsatte dockningsresultatet enligt sin egen poängsättningsfunktion, baserad på poängen och den kombinerade fria energin för varje resultat. Bland alla resultat valdes ett bättre matchningsresultat ut.

Statistisk analys

Envägs ANOVA, följt av Duncans multipla intervalltester med hjälp av SPSS Statistics 20.0 (SPSS, Inc, Chicago, IL, USA) användes för dataanalys med signifikansskillnad (P ≤ 0,05).

Resultat

DH- och ACE-hämmande aktivitet hos GPHs

Som framgår av figur 1A förlängdes DH med tiden under hela hydrolysprocessen. DH ökade snabbt före 2 h-intervallet, därefter minskade ökningstakten gradvis med tiden. I allmänhet var hydrolyshastigheten hög under den inledande 1 h, vilket minskade eller blev konstant efteråt. Bland de fyra proteaserna hade alkalaset den högsta DH som nådde 14,7 % efter 5 timmar, följt av trypsin (8,91 %) och dispas (6,91 %). Den lägsta DH observerades för flavourzyme, som endast var 3,23 % efter 5 h. Dessa resultat antyder att GPI klyvs av proteaser på olika ställen vilket resulterade i proteinhydrolyzater med olika peptidkompositioner.

Vad gäller den ACE-hämmande aktiviteten hos de fyra proteashydrolyserna ökade aktiviteten med DH under tidsperioden. Som framgår av figur 1B var de hämmande aktiviteterna för alkalas, trypsin, dispas och flavourzyme vid 5 timmar 62,70, 39,81, 48,39 respektive 25,95 %. På grund av deras olika klyvningsställen erhölls olika peptider med olika ACE-hämmande aktiviteter. Bland dem var aktiviteten hos det alkaliska hydrolyzat relativt starkare, vilket tyder på att alkaliskt proteas effektivt kan producera ett hydrolyzat med högre ACE-hämmande effekt.

ACE-hämmande aktivitet hos GPH och membranfraktion

Den ACE-hämmande aktiviteten hos GPH och de resulterande fraktionerna var signifikant beroende av MW, vilket framgår av figurerna 1C,D. Vid 1 mg/ml provkoncentrationer ökade den hämmande ACE-aktiviteten gradvis när komponenternas MW minskade. Hämningsaktiviteten vid 3-5 och 5-10 kDa var 44,94 % (IC50 = 1,257 mg/mL) respektive 44,04 % (IC50 = 1,765 mg/mL). Därefter ökade aktiviteten gradvis med lägre MW och nådde den högsta nivån (69,86 %; IC50 = 0,224 mg/mL) vid <1 kDa.

Purifiering av ginkgopeptider

Alkalas används ofta för framställning av aktiva peptider på grund av dess breda specificitet och starka förmåga att bryta ner proteiner. Från ultrafiltreringsbehandlingen visade det sig att den ACE-hämmande aktiviteten förbättrades med polypeptidens minskande MW. Därför renades peptiden i fraktionen <1 kDa ytterligare med hjälp av Sephadex G-15-kolonnen. Det framgår av figur 2A att Sephadex G-15 var uppdelad i tre komponenter (A1, A2 och A3). De tre komponenterna samlades upp och lyofiliserades, och deras ACE-hämmande aktiviteter mättes. Resultaten visas i figur 2B. Den ACE-hämmande aktiviteten hos de tre komponenterna (1 mg/ml) var 64,08, 58,55 respektive 74,96 %. Därför valdes den mest aktiva A3-komponenten ut för strukturell identifiering i nästa steg.

Identifiering av ginkgopeptider och peptidsyntes

För att identifiera den potentiella ACE-hämmande peptiden analyserades den mest aktiva komponenten A3 med LC-MS/MS (kompletterande tabell S1). Baserat på detta screenades tre peptider från A3-komponenten och deras aminosyrasekvenser var Thr-Asn-Leu-Asp-Trp-Tyr (TNLDWY), Arg-Ala-Asp-Phe-Tyr (RADFY) och Arg-Val-Phe-Asp-Gly-Ala-Val (RVFDGAV) (figur 3). De identifierade sekvenserna av dessa peptider bestod av 5-7 aminosyrarester. För att identifiera den ACE-hämmande aktiviteten hos dessa tre peptidfraktioner syntetiserades peptiderna kemiskt. De syntetiserade peptiderna identifierades genom masspektrometri (figurerna 4A-C). Resultaten visade att IC50-värdena för TNLDWY, RADFY och RVFDGAV var 1,932, 1,35 respektive 1,006 mM (figur 4D).

Hämningsmekanism för Ginkgopeptider

Hämningsmekanismen för G. biloba-peptid analyserades enligt Lineweaver-Burk-plotten. Som framgår av figur 5 ändrades både Vmax och Km när Ginkgo peptid TNLDWY tillsattes, Vmax ökade med ökande peptidkoncentration; medan Km inte förändrades signifikant med peptidkoncentrationen vilket indikerade att dess hämmningsmönster kan vara ett icke-kompetitivt hämmningsläge. För RADFY och RVFDGAV förändrades Vmax inte signifikant med koncentrationen, medan Km ökade med ökande peptidkoncentration, vilket tyder på att båda peptiderna är kompetitiva hämmare som kan binda till ACE:s aktiva platser, vilket blockerar ACE:s bindning till substratet och hämmar ACE:s aktivitet.

Molekylär dockningssimulering mellan peptider och ACE

I den här studien utvärderades interaktionen mellan tre peptider och ACE. Resultaten visade att alla peptiderna kunde binda väl till ACE och bilda ett stabilt komplex, vilket tyder på att de kan användas som en potentiell ACE-hämmare. Poängen för Cdocker Interaction Energy visas i tabell 1. Poängen för fraktionerna TNLDWY, RADFY och RVFDGAV var 102,995, 105,335 respektive 117,706. Resultaten av den molekylära dockningen visas i figur 6 och tabell 2. TNLDWY:s optimala dockningsposition kan bilda sex vätebindningar, bland dem bildade den vätebindningar med Ala 354, Tyr523 i S1:s aktiva ficka, His353, His513 i S2:s aktiva ficka och Zn2+-rester, och det konstaterades att den var stabilt bunden med alla dessa. Detta kan vara relaterat till den starka ACE-hämmande aktiviteten hos peptiden. Det observerades i figur 6B att RADFY kan bilda sju vätebindningar med aminosyrarester och intermolekylära vätebindningar med resterna Gln281, His353, His513 och Tyr520 i S2:s aktiva ficka. Bildandet av dessa vätebindningar stabiliserade i hög grad enzymet-peptidkomplexet. Dessutom bildade RADFY en jonisk bindning med Zn2+, konjugerade krafter med Val380, His383, Glu384, His387, Glu411, Lys511 och Tyr523 samt van der Waals-kraft med aminosyrarest Trp356. Dessa interaktioner kan leda till deformation av Zn2+-liganden och inaktivering av ACE. Jämfört med TNLDWY och RADFY kan RVFDGAV bilda fyra vätebindningar med aminosyrarester, vilket var stabilt kopplat till ALA354, TYR523 i den aktiva fickan S1 och Glu162 i den aktiva fickan S1′. RVFDGAV kunde dock bilda joniska bindningar med Zn2+, vilket direkt ledde till deaktivering av ACE-molekyler. Dessutom bildade den ett konjugat med aminosyrarester som Glu162, His353, Glu376, Val379, His387, Phe391, His410, Phe457 och Phe527 (figur 6C).

Diskussion

Under de senaste åren har livsmedelsbaserade ACE-hämmande peptider från växtprotein rönt mer och mer uppmärksamhet på grund av deras färre bieffekter. I den här studien användes alkalas, dispas, trypsin och flavourzyme för att hydrolysa Ginkgo protein. Den DH- och ACE-hämmande aktiviteten hos det hydrolysat av Ginkgoprotein som erhållits genom hydrolys av alkalas rapporterades vara högst. Hydrolysprocessen skedde snabbt under det inledande skedet, vilket resulterade i hydrolys av många peptidbindningar, därefter avtog hydrolyshastigheten på grund av den gradvisa minskningen av substratens tillgänglighet för hydrolys (Ketnawa et al., 2017; Hu et al., 2018; Wei et al., 2018). Dessa resultat stämde överens med den tidigare rapporten om hydrolyserade rapsfröproteinhydrolyser med effektiv ACE-hämmande verkan när de hydrolyserades med alkalas (He et al., 2013).

Angiotensinkonverterande enzym är ett multifunktionellt extracellulärt dipeptidas som finns i olika vävnader. Den hämmande aktiviteten hos ACE sänker blodtrycket genom att minska produktionen av angiotensin II och minska destruktionen av kininer (Zheng et al., 2017). Den ACE-hämmande aktiviteten hos hydrolyzat var relaterad till molekylviktfördelningen. Ultrafiltrering användes för att separera Ginkgo hydrolyzat i fem komponenter. Vid molekylvikt <1 kDa rapporterades den ACE-hämmande aktiviteten hos Ginkgohydrolyzat som högst. Denna observation överensstämde med tidigare studier som rapporterar högre ACE-aktivitet hos polypeptider med låg MW (Wang et al., 2015; Ola et al., 2017). Dessutom bekräftade Silvestre et al. (2012) att ultrafiltreringsbehandlingen kan behålla peptider (AAA) vid C-terminalpositionen för att främja den ACE-hämmande aktiviteten.

För att ytterligare rena den högaktiva ACE-hämmande peptiden separerades Ginkgokomponenten (<1 kDa) med hjälp av gelfiltreringskromatografi och aminosyresekvensen identifierades med hjälp av LC-MS/MS. På så sätt erhölls tre nya ACE-hämmande peptider: TNLDWY (1,932 mM), RADFY (1,35 mM) och RVFDGAV (1,006 mM) som visade stark ACE-hämmande aktivitet. Enligt rapporten från Hernández-Ledesma et al. (2011) var de flesta ACE-hämmande peptiderna korta sekvenser bestående av 2-12 aminosyror. Dessutom var aktiviteten hos den ACE-hämmande peptiden starkt relaterad till närvaron av dess C-terminala aminosyra, aromatiska aminosyra och hydrofoba aminosyra. Närvaron av den aromatiska aminosyran (Tyr, Phe och Trp) ökade till exempel avsevärt aktiviteten hos den ACE-hämmande peptiden. Dessutom är Arg också känt för att spela en viktig roll i den hämmande peptiden. Toopcham et al. (2017) visade att den hämmande aktiviteten hos polypeptiden minskade betydligt efter avlägsnande av Arg. Vidare visade Liu et al. (2018) att aminosyra som Leu i peptiden signifikant påverkade den ACE-hämmande aktiviteten oavsett dess position vid C-terminus eller N-terminus. Liknande resultat rapporterades också av Lee och Hur (2017). Dessa studier rapporterade KPLL-, VLAQYK- och DLP-peptiderna från olika proteinmaterial med en märkbar ACE-hämmande aktivitet i närvaro av hydrofob aminosyra (Leu). I vår studie var Tyr placerad vid C-terminus av TNLDWY och RADFY. Dessutom innehöll de två peptiderna från RADFY och RVFDGAV Arg vid N-terminus, och innehållet av hydrofoba aminosyror i de tre peptiderna var högre. Framför allt motsvarade peptidfragmenten de strukturella egenskaperna hos ACE-hämmande peptider.

Hämningssättet hos ACE-hämmande peptider observerades generellt icke-kompetitivt, kompetitivt och blandat. För korta peptider (2-12 aminosyror) var de flesta av dem kompetitiva hämmare och de fäste sig vid ACE-enzymet för att förhindra bindningen av substratet HHL. En liknande studie av Lin et al. (2017) visade att peptiderna KYIPIQ och LPLPLL från Qula-kasein uppvisade ett kompetitivt inhibitionsläge. När det gäller icke-kompetitiva hämmare binder de dock till andra platser än enzymets substratbindningsställe och påverkar i slutändan substratets bindning till enzymet. Liknande mönster observerades när det gäller livsmedelsburna hämmande peptider som PFPGPIPN från Qula-kasein och hasselnötspeptiden YLVR (Lin et al., 2017; Liu et al., 2018). I detta kompetitiva läge bildade ACE, substrat och peptid ett enzym-substrat-inhibitor-komplex, vilket förhindrade ytterligare frisättning av produkten och resulterade i en minskning av Vmax (Barbana och Boye, 2011).

Studier av den molekylära interaktionsmekanismen mellan ACE och inhiberande peptider är till hjälp för att screena och designa nya ACE-hämmande peptider. Det finns dock otillräcklig information om molekylära interaktioner mellan hämmande peptider. Molekylär dockning bygger på ”lås- och nyckelprincipen” för ligander och receptorer och simulerar interaktionen mellan små molekylära ligander och receptorbiomakromolekyler. Bindningssättet och affiniteten mellan dem möjliggör virtuell screening av läkemedel. ACE är ett Zn2+-beroende karboxydipeptidenzym, där Zn2+ är en viktig del av ACE:s aktiva centrum (Pina och Roque, 2009). Enligt tidigare rapporterade uppgifter (Pan et al., 2012) delades de viktigaste interaktionsresterna på ACE:s aktiva centrum in i tre aktiva fickor (S1, S2 och S1′). S1 (Ala354, Glu384 och Tyr523), S2 (Gln281, His353, Lys511, His513 och Tyr520) och S1′ (Glu162-residens). På ACE:s aktiva plats utgjorde två histidiner (His383 och His387) tillsammans med Glu 411 en Zn2+-ligand. Det har rapporterats att hämning av peptidinducerad ACE-aktivitet kan uppnås genom kombinationen av vätebindningsstabila enzym-peptidkomplex (Fu et al., 2017). Dessutom kan bildandet av van der Waals-krafter med aminosyrarester som His353, Ala 354, Ser355, Glu384, His513 och Pro519, konjugerad interaktion med Tyr360 och icke-kovalenta interaktioner med Glu384, Arg522 också bidra till stabiliteten hos enzympeptidkomplex. Närvaron av dessa krafter kommer att göra strukturen av enzym-peptidkomplexet stabilare, mer gynnsamt för hämning av ACE-aktivitet, vilket kan vara orsaken till den starka ACE-hämmande aktiviteten hos TNLDWY, RADFY och RVFDGAV.

Slutsats

I den här studien användes G. bilobas frön för att förbereda potentiella ACE-hämmande peptider. GPHs framställda från olika proteaser uppvisade olika ACE-hämmande aktivitet in vitro. Den högsta DH- och in vitro ACE-hämmande aktiviteten observerades i GPHs framställda från alkalas. De komponenter som erhölls genom ultrafiltrering med alkalas visade att de peptider med mindre MW-värde gav den starkare ACE-hämmande aktiviteten. Tre potentiella ACE-hämmande peptider (TNLDWY, RADFY och RVFDGAV) erhölls från peptidfraktionen (<1 kDa) genom LC-MS/MS. RVFDGAV visade den högsta ACE-hämmande aktiviteten med ett IC50-värde på 1,006 mM och framstod som en kompetitiv hämmare. Molekylära dockningsresultat visade att peptiderna kunde binda fast till ACE och interagerade vidare med aminosyrarester vid ACE:s aktiva plats. Våra resultat visade att peptiderna som erhållits genom enzymatisk hydrolys av alkalas uppvisade effektiv ACE-hämmande aktivitet in vitro, vilket gör dem till potentiella kandidater för utveckling av funktionella livsmedel eller antihypertensiva läkemedel i framtiden.

Författarbidrag

F-FM, HW, C-KW och KT var involverade i projektets utformning, utförde de flesta av experimenten och utarbetade manuskriptet. Z-JW och LJ bidrog till den experimentella utformningen, utarbetandet av manuskriptet och inlämnandet. Alla författare deltog i skrivandet av manuskriptet och/eller granskade det kritiskt med avseende på viktigt intellektuellt innehåll.

Finansiering

Denna studie stöddes av de större projekten för vetenskap och teknik i Anhuiprovinsen (17030701024, 17030701058 och 17030701028) och viktiga forsknings- och utvecklingsprojekt i Anhuiprovinsen (1704g07020110 och 1804b06020347).

Intressekonfliktförklaring

HW var anställd av Anhui Habopharmqnceutical Co, Ltd. Z-JW var anställd av Anhui Qiangwang Seasoning Food Co., Ltd.

Restande författare förklarar att forskningen utfördes i avsaknad av kommersiella eller finansiella relationer som skulle kunna tolkas som en potentiell intressekonflikt.

Supplementary Material

Supplementary Material for this article can be found online at: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2018.01579/full#supplementary-material

Footnotes

1. ^ http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do