Isolering, karakterisering och toxikologisk potential av Alternaria-mykotoxiner (TeA, AOH och AME) i olika Alternaria-arter från olika regioner i Indien

Insamling och isolering av Alternaria-arter

De infekterade delarna såsom blad, frukter och stammar av sjuka växter från olika regioner i Indien samlades in och fördes till laboratoriet. Bladproverna ytsteriliserades med 0,5 % natriumhypokloritlösning, tvättades noggrant med sterilt destillerat vatten (SDW) flera gånger och placerades på kulturmedium potatisdextrosagar (PDA) i Petriskålar i 3-4 dagar. PDA-plattorna med infekterade bladdelar inkuberades vid 28 °C med 12 timmars ljus/mörker-fotoperiod i 6-10 dagar57. För att undvika bakteriell kontaminering kompletterades med streptomycin i mediet. Konidierna producerades enkelsporerade för att erhålla rena kolonier som placerades på steriliserat filterpapper.

Patogenicitetstest

För att bestämma formae specials utfördes virulensanalys av isolaten på tomatodlingar som är mottagliga för Alternaria. Totalt 60 isolat av Alternaria testades för patogenicitet. Tomatfrön scarifierades i natriumhypoklorit, sköljdes i kranvatten och lufttorkades sedan. Plantorna odlades separat i krukor. Fysiologiska förhållanden som temperatur och luftfuktighet för växternas tillväxt upprätthölls vid 28-32 °C och 40-60 % relativ luftfuktighet. Optimal koncentration av inokulum bibehölls (2 × 106 sporer/ml) och sprayades på bladytan. Växterna i försöket hölls i daggkammare i 8 timmar vid 25 °C. Växterna övervakades regelbundet under 2-3 dagar för att se hur allvarlig infektionen var och hur sjukdomen utvecklades jämfört med kontrollbladet som var oinokulerat. Symptomen började bli synliga 1 dag efter det att sporerna sprutats. Sjukdomens svårighetsgrad bedömdes från 1 dag efter inokulering till 6 dagar. Data analyserades statistiskt med hjälp av variansanalys (ANOVA) och Duncans test (P ≤ 0,05).

DNA-extraktion och identifiering av patogen

Patogenen identifierades inledningsvis utifrån morfologiska egenskaper, inklusive storlek och form, och konidiernas struktur, och bekräftades ytterligare genom ITS-amplifiering med hjälp av universella primers ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′) och ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGATGC-3′) som amplifierar ITS-regionerna och 5.8S-gener som kodar för svamparter. DNA-extraktion utfördes enligt den metod som föreslås av Doyle och Doyle58. En lyofiliserad mycellmatta på 0,5 g krossades i en mortel med 10 ml CTAB-extraktionsbuffert och inkuberades sedan vid 65 °C i vattenbad i 30 minuter. Provet blandades sedan med en lika stor volym kyld kloroform/isoamylalkohol och blandades försiktigt följt av centrifugering vid 10 000 rpm i 10 minuter vid 4 °C. Den supernatant som erhållits på detta sätt blandades med en lika stor volym isopropanol och lämnades i 2 timmar vid 4 °C. Provet centrifugerades återigen vid 10 000 rpm i 10 minuter vid 4 °C. Pelleten sköljdes sedan med 70 % etanol och lufttorkades i 4 timmar för att avlägsna spår av alkohol. Reaktionen för amplifiering av ITS rDNA utfördes i 25 μl reaktionsblandning som innehöll 2,5 μl 10X-reaktionsbuffert, 5 μl av varje desoxyribonukleotidtrifosfat (dNTP) och 1,0 μl av vardera av den universella framåtgående primern (ITS1) och den universella omvända primern (ITS4) för ITS och 5,8 S-regionen, 0,3 μl av Taq DNA-polymeras, 10-100 ng DNA och 2,5 μl MgCl2. Den optimerade termiska profilen för PCR var inledande denaturering vid 95 °C i 3 minuter, denaturering vid 95 °C i 30 sekunder, glödgning vid 70 °C i 30 sekunder och slutlig förlängning vid 72 °C i 1 minut med ytterligare 40 cykler. Amplifikationen bekräftades på 1 % agarosgeler i 0,5X TBE-buffert, kördes parallellt med standard DNA-molekylviktsmarkörer och visualiserades under UV-transilluminator.

ITS-sekvensanalys

De erhållna ITS rDNA-regionerna hos de utvalda isolaten klipptes ner ytterligare och renades med hjälp av QIAquick PCR purification kit (QIAGEN, Tyskland), enligt tillverkarens instruktioner. De renade produkterna skickades slutligen till SciGenome Cochin, Kerala, Indien för sekvensering. Sekvenserna jämfördes med sekvenserna i GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) med hjälp av NCBI BLAST. BLAST-analysen utfördes med ITS-sekvenser i full längd som förfrågningar för att avslöja släktskap med publicerade sekvenser. Högsta homologi och totalpoäng noterades för vidare analys. De sekvenser som erhölls i den aktuella studien lämnades in till GenBank. ITS-sekvenserna av Alternaria-stammar från andra formae speciale hämtades från NCBI:s GenBank-databas och användes i de fylogenetiska analyserna som referenssekvenser. Alla DNA-sekvenser anpassades med programmet Clustal W som ingår i BioEdit sequence alignment editor59, 60. Den resulterande filen med multipla anpassningar användes för fylogenetiska analyser som utfördes med hjälp av MEGA 5.0 med Neighbor-Joining-metoden som tillåter 500 bootstrap-repliker61.

Extraktion av toxiner från Alternaria-arter

Extraktioner av de toxiska metaboliterna utfördes enligt Andersen et al.62 med vissa modifieringar. Extraktionerna av dessa fytotoxiner utfördes på PDB-medium (Potato Dextrose Broth) med hjälp av 20 dagar gamla kulturer. Tre agarproppar (3 mm) skars ut från mitten av varje Alternaria-koloni och inokulerades i 200 ml PDB-medium. Kolonier av patogenen skars av med hjälp av en korkborr (5 mm) och kolonierna inokulerades sedan i PDB-mediet. Tjugo dagar gamla kulturer filtrerades genom filterpapper med hjälp av vakuumfiltermaskinen. Lika stor volym metanol tillsattes i kulturfiltraten, blandades ordentligt och förvarades vid 4 °C i 24 timmar. Därefter fälldes filtratet ut och metanolen avdunstades till torrhet i en roterande vakuumkoncentrator (IKA® RV 10) vid 43 °C. En lika stor volym etylacetat tillsattes till det extraherade filtratet och blandades ordentligt i en separeringstratt. Två faser erhölls, en organisk fas och en vattenfas. Det vattenhaltiga skiktet separerades och extraherades med etylacetat. Etylacetatextraktet koncentrerades vid 44 °C i vakuumförångare och löstes i metanol.

Rensning och separation av Alternaria fytotoxin via kolonnkromatografi

Rensning och separation av föreningar utfördes med hjälp av metodik av Devi et al.63 med små ändringar. Kolonnkromatografi (CC) utfördes i en glaskolonn (700 mm × 30 mm) och kiselgel (100-120 mesh storlek Merk) valdes som stationär fas. Den rörliga fasen bestod av rent lösningsmedel eller olika lösningsmedel beroende på vilka förhållanden som krävdes. Kolonnen laddades med råkomplex som extraherats från isolat av Alternaria-arter. För separering av toxiska metaboliter användes en mobil fas bestående av kloroform: metanol (80:20 och 95:05), bensen: aceton: ättiksyra (60:35:05) för separering av föreningar och en gradienteluering följdes. Olika fraktioner som eluerades från CC separerades genom tunnskiktskromatografi (TLC) och bekräftades genom HPLC-analys.

Tunnskiktskromatografi (TLC)-analys av fytotoxiner

Tunnskiktskromatografi (TLC) användes för att identifiera de olika fytotoxiner som produceras av såväl stora som små sporer av identifierade Alternaria-arter. TLC utfördes enligt Andersen et al.64. I denna metod tillsattes 4,5 g kiselgel G254 (13 % CaSO4 ½ H2O som bindemedel) med 25 ml dubbeldestillerat vatten och rördes om med en glasstav tills en slam av kiselgel bildades. Därefter applicerades slammet försiktigt på en glasplatta och placerades på en säker plats för lufttorkning. Olika rörliga faser användes för separation av olika fytotoxiner i förhållandet kloroform: metanol (80:20; v/v), bensen: aceton: ättiksyra (60:35:5; v/v), kloroform: metanol (95:5; v/v), etylacetat: bensen (95:5; v/v). Dessa lösningsmedelsblandningar placerades sedan i exsickatorer och lämnades i 30 minuter för att mätta miljön i dem. Innan TLC utförs laddades glasplattorna belagda med kiselgel genom att de ställdes in i en ugn vid 60 °C i 10 minuter. Efter laddning drogs 5 µl prover på olika punkter 2 cm från basen. Efter att proverna har prickats torkades TLC-plattorna i en exsickator i några minuter. De resulterande fläckarna utvecklades genom att TLC-plattorna exponerades för 0,2 % etanolisk järnklorid eller visualiserades under UV-ljus vid 365 nm. TLC-plattorna lufttorkades sedan över natten, varefter Rf-värdena beräknades. De fläckar av olika metaboliter vars Rf-värden befanns likartade med standardernas Rf-värden skraptes ut, löstes upp i metanol av HPLC-kvalitet och användes för HPLC-analys.

HPLC-UV-analys

Förberedelse av standarden

TeA (kat. nr: T1952), AOH (kat. nr: A4675) och AME (kat. nr: A4678) köptes från Biogenuix (LKT laboratories, Inc., New Delhi, Indien) och användes i kristalliserad form för att förbereda standarden. Stamlösningen (1000 µg ml-1) och en separat arbetslösning (10 µg ml-1) av toxinerna framställdes i metanol av HPLC-kvalitet och förvarades vid -20 °C för vidare användning. Dessa toxiner användes som standarder för HPLC-kalibrering och för andra ytterligare experiment genom att späda ut de beredda arbetslösningarna.

HPLC-UV-analysförhållanden

För HPLC-analys separerades proverna kromatografiskt med hjälp av en basdeaktiverad (250 mm lång × 4.6 mm, 5,0 µm partikelstorlek) C18 Waters Spherisorb, ODS2-kolonn (produktnummer: PSS831915, USA) som var ansluten till bevakningskolonnen, Waters seriesystem (Waters, Waters Corporation, Milford, USA) med UV-VIS-detektor (2998 PDA) och Waters 600E systemkontroll. 2998 PDA-detektorn är inställd på 254 nm som integrationsvåglängd. Proverna injicerades med hjälp av en 10 μl-slinga i Waters 717plus autosampler (Waters Corporation, Milford, USA). Kolonnen och skyddskolonnen reglerades termostatiskt vid 28 °C. Flödeshastigheten var 0,70 ml/min och den rörliga fasen bestod av 75 % metanol av HPLC-kvalitet (lösningsmedel A), 25 % av en vattenlösning (lösningsmedel B) av 0,1 M fosfatbuffert som tillsattes 900 ml DW för 1 liter och pH 5,8 bibehållet med fosforsyra. Instrumentet kördes i linjärt isokratiskt läge och detektionen övervakades i intervallet 200-400 nm. Tillförlitligheten hos HPLC-metoden för analys av AME, TeA och AOH validerades genom detektionsgränsen (LOD) och kvantifieringsgränsen (LOQ).

LC-MS/MS-analys

För ytterligare bekräftelse av Alternaria-toxinerna (AME, AOH och TeA) har en kromatografi-tandem-masspektrometrisk (LC-MS/MS)-metod utförts med smärre ändringar av Tölgyesi et al.65. Metoden innebär en extraktion i fast vätska med metanol och en efterföljande derivatisering för TeA, AOH och AME. Därefter renades proverna med fastfasextraktion på polymerbaserade patroner och slutligen separerades toxinerna med LC-MS/MS. För LC-MS/MS-analysen bereddes proverna stegvis.

Reagens, lösningsmedel och beredning av standarden

Torkade analytiska kalibratorer av AME, AOH och TeA köptes från Biogenuix (LKT laboratories, Inc., New Delhi, Indien). Standarderna rekonstituerades med 1,0 ml metanol för att erhålla 0,1 mg ml-1 stamlösningar. Alla stamlösningar förvarades vid 4 °C. 2,4-dinitrofenylhydrazin (DNPH) och undekanal köptes från Sigma-Aldrich. Derivatiseringsreagenset (0,58 % DNPH i HCl-lösning) framställdes enligt Siegel et al.7. Stoppreagenset var 5 % (v/v) undekanal i metanol. De derivatiserade TeA-, AOH- och AME-standardlösningarna (1,91 μg/ml, 2,54 μg/ml respektive 2,71 μg/ml metanol) framställdes genom att blanda 1 ml av 10 μg/ml metanoliska TeA-, AOH- och AME-lösningar med 1 ml DNPH-lösning. Blandningen lämnades över natten och behandlades som beskrivet i avsnitten om provextraktion och SPE-rengöring. Slutvolymen justerades till 10 ml med metanol. Dessa lösningar användes för att optimera LC-MS/MS-förhållandena för analysen. Totalt 50 mM ammoniumformiatbuffert framställdes i vatten och pH justerades till 3,0 med myrsyra. Metanol och acetonitril var av LC-MS-kvalitet från Sigma-Aldrich. Etylacetat, n-hexan, diklormetan, myrsyra och ammoniumformiat var av HPLC-kvalitet och köptes från Merck (Darmstadt, Tyskland). Kinetex C-18 UPLC LG 500-kolonnen (3 × 100 mm, 2,6 μm), Strata SPE-kassetter (6 ml, 200 mg) och sprutfilter av regenererad cellulosa (RC) (15 mm, 0,45 μm) erhölls från Phenomenex (Utrecht, Nederländerna). Supelco Ascentis Express C-18, cyano (ES-CN) och fenylhexyl HPLC-kolonner (2,1 × 100 mm, 2,7 μm) köptes från Sigma-Aldrich. Standardtoxinprover som användes vid metodutvecklingen köptes från Biogenuix (LKT laboratories, Inc., New Delhi, Indien). Proverna förvarades vid -20 °C tills de analyserades.

Provextraktion

Prover för extraktion av råmetaboliter renades genom kolonnkromatografimetod och fraktionen eluerades och löstes upp i metanol. 50 ml prov från varje fraktion blandades i 50 ml centrifugeringsrör av polypropylen (PP) som sedan förseglades. Proverna vortexblandades i 5 sekunder och skakades horisontellt i en CAT S50 shaker med en hastighet av 600 min-1 i 45 minuter i omgivningstemperatur. Därefter centrifugerades rören vid 5 000 rpm i 10 minuter vid 20 °C och det övre lagret samlades upp i ett nytt 50 ml PP-centrifugeringsrör. 100 μl derivatiseringsreagens (0,596 % DNPH i 2 mol/lit HCl) tillsattes till provet och vortexblandades i 5 sek. Provet lämnades för derivatisering i 1 timme i rumstemperatur. Därefter tillsattes 500 μl stoppreagens 5 % (v/v) undekanal i metanol och virvelblandades i 5 sekunder. Provet fick stå i 30 minuter och späddes sedan i PP-röret upp till 35 ml med 50 mM ammoniumformiatbuffert (pH 4, justerat med myrsyra). Provet centrifugeras vid 5 000 rpm i 10 minuter vid 20 °C och genomgår en rening genom fastfasextraktion.

Rening genom fastfasextraktion (SPE)

Strata-XL-patroner (200 mg, 6 ml, 100 μm) konditionerades med 6 ml metanol följt av 6 ml vatten och 6 ml 50 mM formiatbuffert. 75 ml behållare kopplades till patronerna och proverna laddades i behållarna. Därefter droppades proverna ut droppvis. Därefter tvättas SPE-kolonnerna med 6 ml metanol-vatten (15/85, v/v) och därefter med 6 ml n-hexan. Patronerna vakuumtorkades i 5 minuter innan proverna eluerades i glasrör med 5 ml metanol. Proverna avdunstades till torrhet vid 45 °C under en svag ström av kväve och löstes på nytt i 250 μl metanol genom vortexblandning i 20 sekunder. Som ett sista steg filtrerades proverna genom filter av regenererad cellulosa till HPLC-flaskor.

Instrumentering och utrustning

Metodutvecklingen utfördes med hjälp av en Ascentis Express C-18 (2,1 × 100 mm, 2.7 μm) UPLC LG 500 nm-system (Accucore RP-MS 100 × 3,0 MM, 2,6UM, ACQ-TQD-QBB1152, Waters acuity PDA-detektor, Waters Corporation, Milford, MA, USA) kopplat till en MassLynx trippelkvadrupol MS-detektor (Waters, Milford, MA, USA). Datainsamling och utvärdering utfördes med MassLynx version 4.0. Den slutliga metoden överfördes också till ett Thermo ACQ-TQD Quantum Ultra LC-MS/MS-system (Thermo Finnigan, San Jose, CA, USA) med en binär Waters acquity QSM-pump (SN-L10QSM943A), en Waters acquity fin autosampler (SN-M10SDI443M), en kolonntermostat och en TQD Quantum Ultra trippelkvadrupol MS-detektor. Kolonnens måltemperatur och provets måltemperatur var 30 °C respektive 10 °C. Datainsamling och utvärdering utfördes med hjälp av Xcalibur-programvaran 2.0.7. SP1. Båda systemen var utrustade med ett elektrospraygränssnitt (ESI) där enbart negativ jonisering användes under insamlingen. Kväve användes som torknings- och kollisionsgas. Jonkällans parametrar sammanfattas i kompletterande tabell S2. Vidare undersöktes metodens överförbarhet med ett LC-MS/MS-system som bestod av en Agilent 1100 HPLC kopplad till en AB Sciex 4000 trippelkvadrupol-MS (Framingham, MA, USA).

Instrumentförhållanden

Alternaria-toxinerna separeras på en Ascentis Express C-18 (2,1 × 100 mm, 2,7 μm) UPLC-kolonn som är utrustad med en 2,1 mm C-18-förkolonn med linjär gradientelution. Fyra lösningsmedel (lösningsmedel A, B, C och D) blandades med den binära pumpen. Lösningsmedel A innehöll acetonitril (ACN) + vatten (5:95), lösningsmedel B innehöll ACN: 5 % isopropylalkohol (IPA), lösningsmedel C innehöll 100 % metanol och lösningsmedel D innehöll ren ammoniumacetat. Flödeshastigheten var 0,5 ml/min. Lösningsmedlens rörliga fas vid starttiden var 0,0 % A, 30 % B, 30 % C och 40 % D. Vid sluttiden (5 minuter) var lösningsmedlen 0,0 % A, 30 % B, 30 % C och 40 % D. Ett tillräckligt tvättsteg i gradientprogrammet var nödvändigt för att avlägsna de ackumulerade lipofila matrislösliga ämnena. Den totala analystiden var 5 minuter. Kolonntermostaten höll temperaturen på 30 °C och injektionsvolymen var 1,0 μl. Autosamplaren kördes vid 20 °C.

UPLC LG 500 nm-systemet kopplades till en MS/MS-detektor (Micromass Quattro Ultima PT) via ett elektrospraygränssnitt (ESI) som fungerar i negativt läge. De optimerade ESI-inställningarna var följande: källtemperatur 120 °C, avsvalningstemperatur 350 °C, torkningsgasflöde 650 L/Hr, kongasflöde 30 L/Hr och kapillärspänning 3,50 kV. Kväve används som torknings- och kollisionsgas (2,67 × 10-6 bar). MRM-läge (Multiply monitoring reaction) tillämpades i MS under detektionen och två jonövergångar skannades för varje måltoxin. MRM-läget tillämpades i MS/MS-detektorn och två jonövergångar (kvantifiering och kvalificering) registrerades för varje målförening. De utvalda jonövergångarna med optimerade spänningar (kon- eller rörlins), kollisionsenergier (CE) och uppehållstider sammanfattas i tabellen (Supplementary Table S2).

Bedömning av den toxikologiska potentialen hos olika Alternaria-mykotoxiner (TeA, AOH och AME)

Mätning av omfattningen av den celldöd som induceras av olika mykotoxiner bestämdes med hjälp av metoden för inokulering av fristående blad. För detta ändamål lossades färska bladprover från växthusodlade plantor och tvättades ordentligt i 3-4 minuter i rinnande kranvatten, steriliserades i 1,0 % (0,01 g/ml) natriumhypoklorit i ca 1 minut och torkades sedan på ytan med 70 % etanol och sköljdes slutligen aseptiskt noggrant med sterilt destillerat vatten. Slutligen placerades bladen på fuktade filterpapper och punkterades med en steril nål på den nedre ytan. Toxinerna löstes upp i sterilt avjoniserat vatten i en koncentration på 100 μg/ml. Droppar (100 µl) av vart och ett av de tre toxinerna injicerades i de skadade bladen med en fin nål (Dispovan, 1 ml). Ett kontrollprov justerades genom att injicera sterilt destillerat vatten. De behandlade bladproverna hölls i en fuktig kammare (27 ± 0,5 °C och 60 % relativ luftfuktighet) under växthusförhållanden (14 timmars ljus- och 10 timmars mörkercykel vid 27 °C). Regelbundna observationer (var 24:e timme under 6 dagar) gjordes för att upptäcka eventuella förändringar av betydelse för toxikologiska effekter som utvecklades i injicerade prover i förhållande till kontrollprover. Försöksupplägget hade tre upprepningar och den procentuella andelen påverkad bladyta på grund av giftinducerad celldöd mättes med hjälp av en Systronic bladytemätare 211 och beräknades med hjälp av nedanstående formel.

Bestämning av celldöd med hjälp av Evans blue uptake assay

Förlusten av cellens livsduglighet (celldöd) utvärderades med hjälp av Evans blue staining-metoden (Baker och Mock, 1994). Tomatbladen behandlades med samma koncentration (250 μg/ml) av alla tre toxinerna. Behandlade blad färgades med 0,25 % (v/v) vattenlösning av Evansblått i 15 minuter. Efter att ha tvättats med destillerat vatten i 30 minuter skars bladen ut och blötlades med 500 µl N, N-dimetylformamid i 1 timme i rumstemperatur. Den optiska densiteten av den frigjorda Evansblåttet mättes spektrofotometriskt vid 600 nm.

Statistisk analys

Den statistiska analysen utfördes med hjälp av IBM SPSS Statistics ver. 20 via variansanalys (envägs ANOVA) följt av Duncans multipla intervalltest vid P ≤ 0,05 signifikansnivå. Data uttrycktes som medelvärde ± standardavvikelse (SD) för minst tre replikat av varje metabolit. Statistiska dataanalyser analyserades i utvalda 48 isolat av Alternaria-arter som var patogena till sin natur.