Nya bevis för att apolipoprotein C3 och apolipoprotein A5 spelar motsatt roll för lipidmetabolism och kranskärlssjukdom roll för apolipoprotein C3 och apolipoprotein A5 i lipidmetabolism och kranskärlssjukdom

Apolipoprotein C3 (apoC3) och apolipoprotein A5 (apoA5) kodas av APOA1/C3/A4/A5-genkluster. Bevis från genetiska, epidemiologiska studier och grundläggande experiment har konsekvent visat att apoC3 och apoA5 är kritiska modulerare av plasma triglyceridmetabolismen (TG) . Brist på apoC3 eller apoA5 ledde till en signifikant minskad eller ökad plasma-TG-nivå hos människor och möss . Djupgående mekanistiska studier visade att apoC3 hämmade hydrolysen av plasma-TG, upptag av kvarvarande lipoproteiner och främjade hepatisk TG-sekretion, medan apoA5 reglerade plasma-TG-metabolismen på ett helt motsatt sätt . Nyligen genomförda studier visade dessutom att apoC3 och apoA5 spelar ytterligare en roll i metabolismen av kolesterolrester (RC), högdensitetslipoprotein (HDL) och hepatisk TG-metabolism . Dessutom visade storskaliga populationsgenetiska studier att funktionsförlustmutationer i APOC3- och APOA5-genen medförde minskad respektive ökad risk för kranskärlssjukdom (CAD). Således framstår apoC3 och apoA5 som potentiella nya mål för att minska den kardiovaskulära risken. I detta manuskript granskades främst de befintliga bevisen som tyder på den motsatta rollen för apoC3 och apoA5 i lipidmetabolismen och CAD-risken, och man diskuterade ett potentiellt samband mellan dessa två apolipoproteiner.

Genstruktur och uttrycksreglering

Humana APOA1/C3/A4/A5-genkluster är belägna på kromosom 11q23, där APOC3-genen ligger ungefär 35 kbp uppströms från APOA5-genen . Deras sekvenser är evolutionärt bevarade . De regulatoriska regionerna för den mänskliga APOC3-genen innehåller en uppsättning proximal promotor med fyra element (- 283/+ 24) och distal förstärkare med sex element (- 890/- 500) . Tidigare djur- och cellodlingsstudier har visat att APOC3-förstärkaren fungerar som en gemensam regleringssekvens för att styra uttrycket av APOA1-, APOC3- och APOA4-genen i lever och tarm . Tillräckligt leverspecifikt APOA5-genuttryck erhölls dock in vivo med ett XhoI-fragment av 26 kb DNA som endast innehöll APOA5-genen och därmed saknade APOC3-förstärkare . Gao et al. bekräftade vidare att APOC3-förstärkaren inte påverkade APOA5-uttrycket i transgena möss . I själva verket har två element i APOA5:s promotorregion visat sig vara kritiska för att styra dess uttryck i humana hepatiska cellinjer .

Initiering av genuttryck utförs genom specifik bindning av transkriptionsfaktorer till genreglerande element, och molekyler som påverkar denna process kan reglera motsvarande genuttryck. Den konkreta strukturen och regleringsmekanismerna för APOC3:s och APOA5:s genuttryck har granskats på andra ställen , och vi kommer här att fokusera på reglerare som delas av APOC3 och APOA5. Flera molekyler har faktiskt involverats i samma riktningsreglering av APOC3- och APOA5-uttrycket, inklusive uppreglering med hepatocytkärnfaktor 4-α (HNF4-α) och glukos , och nedreglering med AMP-aktiverat proteinkinas , insulin och tumörnekrosfaktor-α (TNF-α) . Dessa ämnen, med undantag för TNF-α, är alla viktiga komponenter som är direkt involverade i glukosmetabolismen, vilket tyder på att APOC3- och APOA5-dysreglering kan bidra till diabetisk dyslipidemi. Motsatt riktning reglering hittades också i att peroxisom proliferator-aktiverad receptor-α (PPAR-α) och farnesoid X-aktiverad receptor (FXR) främjade APOA5 samtidigt som de hämmade APOC3-uttrycket . I motsats till APOA5 innehåller den mänskliga APOC3-genens promotor inte PPAR-α- och FXR-positiva responselement. I själva verket verkade dessa två kärnreceptorer indirekt genom att störa bindningen av andra transkriptionsfaktorer, som HNF4-α, till specifika element i APOC3 och därmed ytterligare hämma APOC3-genens transkription . Fibrater, som är en typ av PPAR-α-agonister, kan alltså delvis ha en plasma-TG-sänkande effekt genom att öka den cirkulerande koncentrationen av apoA5 och/eller minska apoC3-nivåerna. Faktum är att nyligen genomförda studier visade att både fenofibrater och behandling med omega-3 fleromättade fettsyror signifikant minskade plasma apoC3-nivåerna hos människor .

Plasma lipidmetabolism

Lipoproteinfördelning

Cirkulerande apoC3 och apoA5 var huvudsakligen förknippade med triglyceridrikt protein (TRL) och HDL . Studier visade att apoC3 och apoA5 var utbytbara mellan TRL och HDL. I normolipidemiskt tillstånd hos människor var majoriteten av plasma apoC3 bunden till HDL . Hos personer med hypertriglyceridemi (HTG) fanns apoC3 däremot främst på mycket lågdensitetslipoprotein (VLDL) . När koncentrationen av TG i konstgjorda TG-emulsioner ökade, flyttades en större andel apoC3 från plasmalipoproteiner till konstgjorda emulsioner . Glangeaud et al. fann att under den lipoproteinlipas (LPL) medierade hydrolysen av VLDL omfördelades apoC3 från VLDL till HDL i en in vitro-studie, med en mängd som var proportionell mot storleken på TG-hydrolysen i VLDL, och apoC3 överfördes därefter tillbaka till nysyntetiserade TG-berikade VLDL-partiklar . På samma sätt visade Nelbach et al. att apoA5 huvudsakligen var associerat med HDL i APOA5-transgena möss, som hade TG-fattiga VLDL, men att det snabbt och effektivt omfördelades till TG-rika VLDL som isolerats från APOA5-knockoutmöss efter inkubation. Shu et al. rapporterade också att intravenös injektion av apoA5-innehållande rekonstituerad HDL i APOA5-knockoutmöss visade ett identiskt utbytesmönster av apoA5 mellan rekonstituerad HDL och VLDL, och apoA5 förblev fortfarande associerat med det TG-rika VLDL på grund av störningen av VLDL-hydrolysen.

Dessa fynd tyder på att lipoproteinfördelningarna av apoC3 och apoA5 är nära förknippade med TG-innehållet i TRL. Majoriteten av apoC3 och apoA5 fanns i HDL när det fanns låga TG-halter i TRL. En stor del av apoC3 och apoA5 omfördelades från HDL till TRL-partiklar när TG-mängderna ökade i TRL, och de pendlade gradvis tillbaka till HDL med bearbetningen av TRL-hydrolysen. Den biologiska funktionen och regleringsmekanismen för utbytesprocessen har dock inte blivit väl belyst.

Plasma TG

ApoC3 och apoA5 är kritiska bestämningsfaktorer för plasma TG-koncentrationen, vilket framgår av genetiska observationer hos människor. Funktionsförlustmutationer i den mänskliga APOC3-genen gav en låg plasma TG-profil , medan patienter med APOA5-bristmutation hade extremt höga plasma TG-nivåer . Avvikelser i apoC3 och apoA5 var förknippade med olika former av HTG, t.ex. familjär hyperchylomikronemi , familjär kombinerad hyperlipidemi och familjär dysbetalipoproteniemia . Intressant nog visade nyligen genomförda studier att det finns en enda glykosyleringsplats vid tretonin 74 i apoC3-proteinet, vilket ger upphov till fyra huvudsakliga proteoformer i plasma. Wildtypsformen, som inte innehåller någon glykankedja, brukar kallas apoC30a. De övriga tre har alla en kärnglykankedja som består av en O-länkad disackarid galaktos som är kopplad till N-acetylgalaktosamin. ApoC30b är den proteoform som endast innehåller glykankärnan, medan apoC31 och apoC32 innehåller ytterligare en respektive två sialinsyrarester. Dessutom fanns det fyra större proteoformer av apoC3 som var differentiellt korrelerade med TG-nivåerna vid fasta. Med hjälp av masspektrometrisk immunoassaymätning har man funnit att plasma apoC30a, apoC30b och apoC31 hade ett positivt, medan apoC32 hade ett negativt samband med fastande plasmagivning, vilket tyder på att analys av enskilda apoC3-isoformer skulle kunna ge mer omfattande information än enbart den totala koncentrationen av apoC3 i plasma.

Konsistent nog hade APOC3-knockoutmöss minskad TG-koncentration (- 30 %) jämfört med vilda kullsyskon, medan APOC3-transgena möss uppvisade ökad TG-nivå i serum (+ 200 % till 2000 %) . Å andra sidan hade APOA5 knockout en ökning (+ 400 %) av TG-nivåerna medan APOA5 transgena möss uppvisade signifikant minskade (- 70 %) i denna lipidparameter .

Djupgående mekanistiska studier avslöjade att apoC3 och apoA5 reglerade plasma TG-nivåerna genom flera vägar. ApoC3 hämmade LPL-medierad TRL-hydrolys, cirkulerande TRL-rest clearance och främjade hepatisk TG-sekretion. Intressant nog reglerade apoA5 plasma TG-metabolismen på ett helt motsatt sätt. ApoA5 påskyndade nämligen TRL-hydrolys, TRL-resternas upptag i levern samtidigt som den hämmade hepatisk TG-sekretion (fig. 1).

Plasma RC

RC definieras som det totala kolesterolinnehållet i TRL, inklusive VLDL och lipoproteiner med intermediär densitet (IDL) i fastande tillstånd och VLDL, IDL och rester av chylomikroner i icke-fastande tillstånd. Allt fler bevis tyder på att RC är en oberoende kausal riskfaktor för ischemisk hjärtsjukdom . Dessutom var förhöjda RC-nivåer förknippade med ökad dödlighet av alla orsaker hos patienter med ischemisk hjärtsjukdom .

Då apoC3 och apoA5 reglerade TRL-metabolismen är det inte oväntat att finna att APOC3- och APOA5-genvarianter var förknippade med RC-nivåer. I en metaanalys av 137 895 individer var RC 43 % lägre hos APOC3 loss-of-function heterozygoter jämfört med icke bärare . Däremot var genotypkombinationer av vanliga varianter av APOA5 (c.-1131 T > C, S19 W och c.*31C > T) förknippade med ökningar av RC på upp till 56 % . Att rikta in sig på apoC3 eller apoA5 verkar således vara ett potentiellt tillvägagångssätt för att minska RC-nivåerna i plasma, vilket skulle kunna bevisas i framtida prövningar.

HDL

HDL utövar olika ateroskyddande egenskaper, bland annat genom att förmedla kolesterolutflöde, skydda vaskulärt endotel, antiinflammatoriska och antiapoptotiska effekter . HDL med brister i dessa egenskaper kallas dysfunktionell HDL, vilket i sin tur bidrar till utvecklingen av kronisk sjukdom. Observationsstudier på människor tyder på att dessa egenskaper är defekta vid patologiska störningar. Exempelvis fann man nedsatt kolesterolutflödeskapacitet hos HDL från ureumpatienter . Riwanto et al. fann att HDL från CAD-patienter inte aktiverade endoteliala antiapoptotiska vägar, utan snarare stimulerade potentiella endoteliala proapoptotiska vägar. Genom spektrometri och biokemiska analyser visade studierna vidare att försämrad HDL-funktion korrelerade nära med förändringen av dess proteomsammansättning, bland vilka förändringar av apoC3 och apoA5 fick mycket uppmärksamhet.

Riwanto et al. fann att det fanns signifikant högre apoC3 i HDL-partiklar från CAD-patienter jämfört med friska kontroller. Dessutom förbättrade användningen av antikroppar som neutraliserar apoC3 i dessa HDL den HDL-medierade antiendoteliska apoptosfunktionen . Cho KH visade att en ökning av apoC3-innehållet i artificiellt rekonstituerad HDL minskade dess förmåga att aktivera lecitinkolesterolacyltransferas (LCAT). Intressant nog visade Luo M et al. att ApoC3-innehållet i HDL var negativt förknippat med HDL-medierad kolesterolutflödeskapacitet, men den bakomliggande mekanismen är okänd. Däremot ledde adenovirusmedierad överexpression av APOA5 hos möss till ökad apoA5 i HDL, vilket var förknippat med ökad kolesterolutflödeskapacitet . Rekonstituerad HDL syntetiserad med mer apoA5 hade större partikelstorlek, högre lipidinnehåll och bättre antioxidantkapacitet mot LDL in vitro .

Den definitiva rollen för apoC3 och apoA5 i HDL-funktionen måste undersökas ytterligare. Det har rapporterats att apoC3 i HDL kan binda till scavengerreceptor B1 (SR-B1) , med okarakteriserad strukturdomän. SR-B1 är känd som ett viktigt element i den omvända kolesteroltransporten delvis för att underlätta det selektiva upptaget av kolesterolestrar från HDL i levern . Huruvida denna interaktion mellan apoC3 och SR-B1 skulle påverka den omvända kolesteroltransporten är obestämt.

Hepatisk VLDL-sekretion

En av leverns viktigaste funktioner är att syntetisera och utsöndra VLDL. VLDL består av en kärna av neutrala lipider, främst TG, och flera apolipoproteiner . Av dessa är apolipoprotein B100 (apoB100) det viktigaste och ger VLDL-partikeln strukturell stabilitet. Biogenesen av VLDL sker i två steg. Inledningsvis börjar bildandet av VLDL med syntesen av apoB100 i det endoplasmatiska retikulumet (ER). Den framväxande apoB100 lapas sedan delvis för att bilda en lipidfattig primordial VLDL-partikel, vilket underlättas av mikrosomalt triglyceridöverföringsprotein (MTP). I det andra steget av VLDL-bildningen smälter den primordiala VLDL-partikeln samman med triglyceridrika partiklar för att bilda mogna TG-rika VLDL . Allt fler bevis har visat att apoC3 och apoA5 reglerar VLDL-lipideringen och påverkar det hepatiska TG-innehållet (fig. 1).

Data från cellkulturer, djurförsök och studier på människor bekräftar att apoA5 hämmar VLDL-TG-sekretionen och främjar lagringen av TG i cytosoliska lipiddroppar. McA-RH7777-celler som är stabilt transfekterade med humant APOA5 utsöndrar VLDL som var mindre än de från kontrollceller, men hade högre TG-nivå i cellen och större lipiddroppar . Däremot rapporterade Ress et al. att knockdown av APOA5 i HepG2-celler ledde till en minskning av den cellulära TG-halten. Levern från APOA5-transgena möss hade en ökad hepatisk TG-nivå jämfört med vilda kullsyskon . Qin et al. fann att patienter med icke-alkoholisk fettleversjukdom (NAFLD) har ett förhöjt uttryck av APOA5 jämfört med friska kontroller. Det finns dock fortfarande några gåtor som behövs för att ytterligare belysas. Främst varigenom en del av apoA5 undslipper sekretionsvägen till blodet och blir associerad med cytosoliska lipiddroppar? Dessutom, hur främjar apoA5 hepatisk TG-lagring i lipiddroppar (LD) i stället för utsöndring i form av VLDL.

Omvänt har in vivo- och in vitro-studier visat att apoC3 har en stimulerande effekt på VLDL-lipidering. Att utfodra APOC3 knockout-möss med en fettrik kost i två veckor stimulerade inte produktionen av VLDL-TG, medan återskapande av APOC3-uttryck med adenovirus som kodar för humant apoC3 resulterade i en robust produktion av VLDL-TG . Den stimulerande effekten av humant apoC3 på lipidering av VLDL återskapades i McA-RH7777-celler under lipidrika förhållanden . Dessutom upphävdes denna stimulerande effekt genom en platsinriktad mutation av rester i den lipidbindande domänen (K58E) hos apoC3. Dessa fynd stöddes hos människor av observationerna att två SNPs i APOC3 (C-482 T, T-455C), som leder till minskat APOC3-uttryck, var korrelerade med ökad hepatisk TG-nivå och högre prevalens av NAFLD i den asiatiska indiska befolkningen .

Den subcellulära placeringen av apoA5 och apoC3 som reglerar VLDL-lipidering föreslås vara ER-avdelningen. Gao et al. antog att apoA5 kan underlätta för de ER-luminala LDs att knoppa utåt för att bilda cytosoliska LD och därmed minska den TG som monteras i VLDL-partiklar . Qin et al. fann att apoC3 främjade fusionen av ER-luminala LD med VLDL-partiklar under VLDL-lipidering . Det behövs fördjupade studier som fokuserar på den molekylära grunden som ligger till grund för effekten av apoA5 och apoC3 på VLDL-lipidering och LD-metabolism, vilket kommer att ge en ny förståelse för hepatisk TG-homeostas.

Association med CAD

CAD har blivit en av de viktigaste dödsorsakerna i världen. Lipoproteinkolesterol med låg densitet (LDL-C) är välkänt för att spela en avgörande roll i patogenesen av CAD, och en sänkning av plasma-LDL-C resulterar i en betydande minskning av sjuklighet och dödlighet i samband med CAD . Det har dock rapporterats att många individer fortfarande lider av CAD trots att de har uppnått terapeutiska mål för LDL-C-nivåerna . Därför försöker man nu identifiera andra modifierbara riskfaktorer för att ytterligare minska risken för kronisk sjukdom. Populationsgenetiska data är fria från förväxling och omvänt orsakssamband och erkänns därför som ett viktigt sätt att identifiera nya potentiella riskfaktorer för CAD.

Interessant nog har det visats att genetiskt reducerade apoC3-nivåer i plasma var förknippade med minskad risk för CAD hos människor . En nonsensmutation i APOC3-genen, R19X, var förknippad med en 50-procentig minskning av de cirkulerande apoC3-nivåerna . Ännu viktigare är att bärare av den sällsynta varianten R19X hade lägre förekomst av kranskärlsförkalkning och lägre Framingham 10-års risk för hjärtkärlsjukdom . Den kardioprotektiva effekten av R19X och tre andra sällsynta varianter, två mutationer på skarvstället (IVS2 + 1G → A; IVS3 + 1G → T) och en missense-mutation (A43T) i APOC3-genen, bekräftades nyligen i två storskaliga studier . I en studie som en del av Exome Sequencing Project of the National Heart, Lung, and Blood Institute , var ungefär 1 av 150 deltagare heterozygot bärare av minst en av dessa fyra mutationer, och de cirkulerande nivåerna av APOC3 hos bärare var 46 % lägre än nivåerna hos icke-bärare. Risken för CAD bland 498 bärare av någon sällsynt APOC3-mutation var 40 % lägre än risken bland 110 472 icke-bärare. I en kohort med 75 725 deltagare minskade den kumulativa incidensen av ischemisk kärlsjukdom och ischemisk hjärtsjukdom hos heterozygoter med funktionsförlustmutationer i APOC3 (R19X eller A43T eller IVS2 + 1G → A) jämfört med icke-bärare, med motsvarande riskminskningar på 41 % och 36 %. Det har också rapporterats att det fanns en tendens till färre allvarliga negativa kardiovaskulära händelser hos patienter med högre apoC32-proteoform, medan dessa associationer inte upptäcktes för de andra apoC3-proteformerna, vilket tyder på att apoC32 mer liknar en proteoform med funktionsförlust .

Konträrt nog var APOA5-varianter som leder till minskade apoA5-nivåer förknippade med ökad risk för hjärt-kärlsjukdom . Sambandet mellan -1131 T > C promotorpolymorfism i APOA5-genen och risken för CAD har visats i en stor metaanalys. Oddskvoten för CAD var 1,18 per C vs T-allel . Dessutom har flera oberoende studier konsekvent visat att APOA5-varianter var signifikant förknippade med risken för hjärtinfarkt (MI). Raffaele De Caterina et al. fann ett starkt samband mellan genvarianten APOA5 -1131 T > C och tidig akut hjärtinfarkt. Jorgensen AB et al. visade vidare att genetisk variation i APOA5-genen (c.-113131 T. C, S19 W och c.*31C. T) är förknippad med en 87-procentig ökning av risken för hjärtinfarkt . Do R et al. sekvenserade exonerna av APOA5 hos 6721 personer med hjärtinfarkt och 6711 kontroller. 46 unika icke-synonyma varianter av enskilda nukleotidvarianter eller indel-ramförskjutningar med en allelfrekvens på < 1 % identifierades. Dessutom hade bärare av dessa sällsynta mutationer i APOA5-genen (1,4 % av fallen jämfört med 0,6 % av kontrollerna) en 2,2-faldigt ökad risk för hjärtinfarkt jämfört med kontrollerna .

Det har dessutom föreslagits att effekterna av apoC3 och apoA5 på risken för hjärtkärlkirurgi delvis förmedlas av förändringar i plasma-RC-nivåerna. Wulff AB et al. fann att RC medierade 37 % av den observerade 41 % lägre risken för ischemisk kärlsjukdom och 54 % av den observerade 36 % lägre risken för ischemisk hjärtsjukdom hos heterozygoter med APOC3-förlust av funktion jämfört med icke-bärare . APOA5-genvarianter (c.-1131 T. C, S19 W och c.*31C. T) som leder till genetiskt ökad RC är dock förknippade med en ökad risk för hjärtinfarkt . Å andra sidan kan APOA5-genvarianter (c.-1131 T. C, S19 W och c.*31C. T) förknippade med ökningar av RC på upp till 56 % och med en motsvarande oddskvot för MI på 1,87 .

Potentiell korrelation mellan apoC3 och apoA5

Med tanke på att apoC3 och apoA5 reglerar lipidmetabolismen och är förknippade med CAD-risken på ett motsatt sätt är det rimligt att fråga sig om de fungerar oberoende av varandra eller samarbetar. Vissa fynd från genetiska möss tyder på ett nära samband mellan dessa två proteiner även om det inte finns några aktuella bevis som visar på en direkt interaktion mellan dem. Pennacchio et al. visade att transgena APOA5-möss och knockout-möss har en uppenbart minskad respektive ökad halt av apoC3-protein i levern, samtidigt som inga signifikanta förändringar har hittats i apoC3 mRNA-antalet. Faktum är att mängden apoC3-protein i levern ökade med 90 % hos APOA5-knockoutmöss och minskade med 40 % hos APOA5-transgena möss jämfört med kullsyskon av vildtyp. På samma sätt observerades en minskad apoC3-nivå i serum efter adenovirusmedierad överexpression av humant APOA5 hos möss . Dessa resultat tyder på att apoC3 kan påverka apoA5 på transkriptionsnivå och vice versa. De underliggande mekanismerna är dock okända.