Nya insikter om apoptosoms struktur och funktion

Från början var strukturell information avgörande för att avslöja apoptosoms domänorganisation. Den mänskliga apoptosomen innehåller sju Apaf-1-molekyler som är symmetriskt arrangerade i en hjulformad struktur för att bilda ett centralt nav som består av NODs med sju förlängda HD2-armar, som var och en slutar i en V-formad region som bildas av de två β-propellrarna . α/β-fältet i NBD och HD1 binder ADP/dATP mellan sig, medan WD40-repetitionerna bildar de 7- och 8-bladiga β-propellerna . I motsats till tidigare antydningar visade det sig att laterala interaktioner mellan α/β-fold av intilliggande Apaf-1-molekyler används för att organisera det centrala navet, medan N-terminala CARDs sitter ovanför denna ring och är oordnade i avsaknad av pc-9 (PDB 3J2T) . Nya nära atomstrukturer har dock visat att Apaf-1 CARDs bildar en skivliknande funktion på ytan av den aktiva apoptosomen i närvaro av pc-9 CARDs, och detta arrangemang skiljer sig från det som finns i CED-4 och Dark (fig. 1 och 2) . Stabiliteten hos det centrala navet upprätthålls av ett komplext nätverk av α-helikala interaktioner, vätebindningar och saltbryggor mellan intilliggande NBD- och HD1-moduler från angränsande Apaf-1-molekyler . WHD/HD1-kontakterna på intilliggande protomerer verkar stödja apoptosomsammansättningen med WHD-domäner som överbryggar intilliggande NBD- och HD1-domäner . Som i Mörk är ISM-helixen i Apaf-1 (α12) parad med helix α13 genom omfattande hydrofoba interaktioner för att bilda ett helix-slinga-helixmotiv i varje underenhet, som i sin tur interagerar lateralt med intilliggande underenheter för att bilda ett spiralformigt staket som kantar den centrala poran i ringen .

I friska celler existerar Apaf-1-monomerer i en sluten, inaktiv konformation med ADP inbäddat i en spricka i gränssnittet för NBD-HD1 (PDB 1Z6T, 3SFZ) . Denna slutna konformation förutsäger att det krävs omfattande konformationsförändringar av monomeren för att underlätta apoptosomsammansättning. I motsats till apoptosombildningen i C. elegans och Drosophila binder cytokrom c som frigörs från mitokondrier under apoptossignalering till monomer Apaf-1, vilket utlöser konformationsförändringar som leder till nukleotidutbyte (ATP eller dATP kan ersätta ADP) och efterföljande oligomerisering av en förlängd Apaf-1 för att bilda apoptosomen (fig. 3) . För att förstå de konformationsförändringar som sker behövs exakta modeller av inaktiva och förlängda tillstånd av Apaf-1. Två kristallstrukturer av inaktiva Apaf-1-monomerer med bundet ADP har bestämts, där den ena saknar β-propeller och den andra saknar de N-terminala CARD-domänerna för att underlätta kristalliseringen. NOD i dessa två kristallformer är dock praktiskt taget identiska och detta har gjort det möjligt att konstruera en konsensusmodell för hela Apaf-1-monomern med bundet ADP . Nästan atomära strukturer av den mänskliga apoptosomen har nu uppnåtts av flera grupper med hjälp av cryo-EM med en enda partikel, för att ge en inblick i den förlängda konformationen av Apaf-1 i frånvaro och närvaro av pc-9 (PDB 3JBT, 5JUY, 5WVE; fig. 3) . Som förutspått är Apaf-1:s konformation i det centrala navet, HD2-armarna och den regulatoriska regionen i stort sett identisk i både inaktiva och aktiva apoptosomer . Dessa studier har gett viktiga detaljer om specifika rester som är involverade i van der Waals-kontakter mellan domäner inom enskilda Apaf-1-molekyler, avslöjat rester som är kritiska för domäninteraktioner som stabiliserar den aktiva apoptosomen och visat på interaktioner inom den V-formade sensordomänen i tandem 7- och 8-bladiga β-propellrar, som bildar cytokrom c-bindningsytan

I Apaf-1 apoptosomen är dATP-bindningsstället placerat vid gränssnittet mellan NBD och HD1 och bildas delvis av Walker A-slingan och slingan mellan HD1 och WHD. Apaf-1 kan binda ADP i det inaktiva tillståndet, men det finns en liten preferens för att använda dATP för apoptosomsammansättning in vitro (granskad i ref. ), medan ATP är mycket rikligare in vivo (~ 2 mM för ATP jämfört med 10 μM för dATP). . En viss stabilisering sker genom interaktioner mellan en argininrest (Arg265) i NBD, tillsammans med Ser325 och Tyr359 i HD1 och den bundna ATP/dATP-molekylen. En rotation av NBD-HD1-paret kring α-helix 20 i WHD placerar HD1-WHD-slingan i botten av nukleotidfickan , vilket gör det möjligt för NBD-HD1-paret att bilda cirkumferentiella interaktioner inom det centrala navet under sammansättningen . Detta bryter också interaktioner med WHD som normalt stabiliserar en sluten konfiguration .

Sensor β-propeller och cytokrom c-bindning

Apoptosomhjulets ”ekrar” sticker utåt från navet genom HD2-domänerna och varje arm bildar basen av den V-formade regionen som innehåller de två β-propeller-sensordomänerna. I den längsta Apaf-1 isoformen, (Apaf-1XL) som uttrycks i de flesta vävnader , bildar de femton WD40-repetitionerna tandem 7 och 8-bladiga β-propellrar och en nyligen genomförd kryo-EM-studie visade att detta har en ny stängningsmekanism . Denna topologi för β-propellrarna liknar den som återfinns i aktin interagerande protein (Aip1p), där länkern från HD2 bildar d-strängen i det sista bladet i den 8-bladiga β-propellraren (indikerad av den lilla blå regionen som finns i början av den 7-bladiga propellraren i figur 1a), innan den korsar över för att bilda den 7-bladiga β-propellraren . Denna topologi verifierades av en kristallstruktur av murin Apaf-1 med en upplösning på 3,0 Å och verkar vara bevarad i de mörka β-propellerna .

I Apaf-1-apoptosomen bildar de V-formade β-propellerna cytokrom c-bindningsfickan, och interaktionen med cytokrom c verkar stabiliseras av vätebindningar och saltbryggor . Både reducerade och oxiderade former av cytokrom c kan interagera med apoptosomen för att förmedla dess aktivering . Intressant nog tycks cytokrom c interagera företrädesvis med den 8-bladiga β-propellern, medan en mer begränsad kontaktyta bildas med den 7-bladiga β-propellern . Cytokrom c upplöses med ~ 6 Å upplösning i de nya kartorna, på grund av lokal rörelse och molekylen är roterad ~ 90°, i förhållande till en tidigare modell baserad på molekylär dockning i en karta där spiraler inte löstes upp . Riktad mutagenes avslöjade kritiska rester i cytokrom c som krävs för stabil förening med Apaf-1 β-propellrar, och några av dessa rester (G56, P76, I81) är viktiga för apoptosombildning och efterföljande caspasaktivering .

Truncated Apaf-1-molekyler som saknar WD-40-repetitionsregioner kan också samlas för att bilda apoptosomer som är konstitutivt aktiva men som demonteras med tiden . Detta har föreslagit att β-propellers kan vara något hämmande för sammansättning samtidigt som de stabiliserar Apaf-1 apoptosomen . β-propellers i Apaf-1-apoptosomen är emellertid belägna vid hög radie och interagerar inte med intilliggande subenheter och inte heller med andra domäner i monomeren, med undantag för HD2. Därför förblir destabiliseringsmekanismen mystisk. Även om det är spekulativt kan avsaknaden av β-propellrar i trunkerade apoptosomer försvaga HD2-interaktioner med det centrala navet vilket leder till en tidsberoende disassemblering.

Det står nu klart att cytokrom c-bindning orsakar en uppåtriktad rotation av β-propellerregionen, vilket bryter förbindelsen mellan den 7-bladiga β-propellern och NBD-HD1-paret i den inaktiva Apaf-1-monomern , medan den 7-bladiga β-propellern roterar mot den 8-bladiga β-propellern i en klämrörelse . Dessa händelser destabiliserar den autoinhiberade Apaf-1-konformationen och underlättar nukleotidutbyte genom att främja konformationsförändringar som exponerar ADP-bindningsfickan för att möjliggöra ATP/dATP-bindning . Detta stabiliserar Apaf-1-monomeren i en utsträckt konformation så att den kan interagera med angränsande protomerer. Bandförskjutningsexperiment tyder på att nukleotidutbyte och tillhörande konformationsförändringar i Apaf-1 kan ske som svar på cytokrom c-bindning eftersom inga betydande förändringar i Apaf-1-konformationen upptäcktes med tillsatt dATP i frånvaro av cytokrom c . Sammantaget stöder dessa data en sekventiell modell där cytokrom c-bindning sker före nukleotidutbyte för att underlätta övergången från en sluten till en utsträckt Apaf-1-konformation. Dessutom tyder dessa resultat på att WD40-repetitioner fungerar som sensorer som utlöser den initiala apoptosomsammansättningen genom att binda cytokrom c.

Möjliga mekanismer för aktivering av procaspase-9

Procaspase-9 rekryteras av apoptosomen för att bilda ett holoenzym som ökar dess katalytiska aktivitet . I lösning är pc-9 en konstitutiv monomer när den inte är bunden till Apaf-1, medan aktiva caspaser i allmänhet är dimerer . Det är anmärkningsvärt att en dimerisk interaktion mellan två pc-9-monomerer i ett kristallgitter främjar bildandet av en aktiv plats på den ena katalytiska underenheten, medan den andra underenheten förblir i en inaktiv konfiguration (PDB 1JXQ), och ett liknande fenomen uppträder i CED-3-dimerer vid hög koncentration . Det N-terminala CARD i pc-9 interagerar med Apaf-1 CARD(s) för att rekrytera det apikala procaspaset till apoptosomen och detta främjar aktivering av den katalytiska domänen, som är separerad från CARD genom en lång länk (fig. 2a) . Dessutom är p20- och p10-underenheterna i den katalytiska domänen också förbundna med en länk som är föremål för självspjälkning . För att förstå hur pc-9 aktiveras måste vi alltså förstå CARDs och pc-9-linkers roll i holo-apoptosomen.

Differenta modeller som förklarar mekanismerna för pc-9-aktivering av apoptosomen har föreslagits . Den ”proximity-induced dimerization model” förutsäger att rekrytering av pc-9-molekyler till Apaf-1-apoptosomen kan underlätta homodimerisering, vilket tros leda till autoaktivering av pc-9 . Fram till nyligen hade dock inga strukturella eller biokemiska bevis visat att pc-9 är homodimerisk när den är bunden till apoptosomen (se nedan ). I modellen med ”inducerad konformation” föreslogs att apoptosomen Apaf-1 är en plattform som binder pc-9 för att underlätta dess aktiva konformation . Nya modeller föreslår att aktiveringen av pc-9 främst förmedlas via allosterisk reglering av apoptosomplattformen . I alla dessa modeller är apoptosomens primära funktion att bygga upp ett multimeriskt komplex mellan Apaf-1 och pc-9 CARDs för att underlätta aktiveringen av pc-9 genom att öka den lokala koncentrationen av zymogenet . Dessutom tyder data om en konstruerad pc-9 som är en konstitutiv dimer i lösning på att CARD och dess länk kan hämma de katalytiska domänerna . Därför kan bildandet av en CARD-heterodimer på apoptosomen upphäva denna hämning, men denna idé återstår dock att testa.

Samtidigt som dimerisering kan spela en nyckelroll vid aktivering har det förblivit oförklarat hur detta sker på apoptosomen, och i själva verket har nyligen framkomna data föreslagit möjligheten av en mer komplicerad aktiveringsmekanism som involverar både homodimerisering av pc-9-molekyler och heterodimererbildning av en enskild katalytisk domän av pc-9 med NBD av Apaf-1 . Intressant nog utesluter en inaktiv konformation av Apaf-1-monomern inte pc-9-bindning via CARD-CARD-interaktioner, vilket visades genom bandförskjutningsexperiment . Således kan pc-9/Apaf-1-heterodimerer rekryteras till den apoptosom som håller på att byggas upp som en del av dess aktivering (fig. 3). Det förblir en öppen fråga om sammansättningen av Apaf-1 i närvaro av pc-9 styrs av ytterligare interaktioner mellan CARD-domänerna i den nasala skivan.

En första kristallstruktur avslöjade ett stabilt 1:1-komplex mellan Apaf-1:s och pc-9:s CARD-domäner med ett komplementärt gränssnitt (känt som typ I), vilket är oundgängligt för pc-9-aktivering . Detta stabila 1:1-komplex visade sig dock senare vara otillräckligt för att aktivera pc-9 . Istället bildar Apaf-1:s och pc-9:s CARDs oligomeriska komplex av högre ordning, som främst stabiliseras av två av tre möjliga gränssnitt (typ I, II och III), som också återfinns i andra dödsdomänkomplex . En jämförelse av de interaktioner som är involverade i CARD-CARD-skivan i CED-4-, Dark- och Apaf-1-apoptosomerna visar på ett visst bevarande av typ II- och III-gränssnitt, med CARD-interaktioner av typ I som endast återfinns i den mänskliga apoptosomen . En nyligen framtagen kristallstruktur med en upplösning på 2,1 Å avslöjade ett heterotrimeriskt komplex bestående av två Apaf-1 CARDs med ett pc-9 CARD insprängt mellan dem . Interaktioner av typ II som involverar rester i pc-9 (Arg36/ Arg65) och Apaf-1 (Glu78) CARDs visade sig vara kritiska för aktivering av pc-9 , tillsammans med interaktioner av typ I som beskrivits tidigare . Dessutom kan en enda rest (Glu41 i Apaf-1 CARD) bilda en dubbel interaktion med en pc-9 CARD i ett minimalt typ III-gränssnitt . Ytterligare interaktioner med Lys58 och Lys62 på Apaf-1 CARD visade sig också vara nödvändiga för pc-9-aktivering och kan bidra till att placera Apaf-1 CARDs på plattformen . Bildandet av ett heterotrimert CARD-komplex ger således ett sätt att binda flera katalytiska pc-9-domäner till apoptosomplattformen.

Två strukturer med nära atomupplösning av den aktiva Apaf-1-apoptosomen har avslöjat att den övergripande arkitekturen hos Apaf-1:s och pc-9:s CARD-skivarrangemang skapar en lutande skiva som sitter ovanför det centrala navet (fig. 2 och 3) . Symmetriobalansen mellan skivan och plattformen resulterar i en acentrisk placering av CARD-skivan när den betraktas ovanifrån (fig. 3) . Skivan kan beskrivas som en spiral av Apaf-1 och pc-9 CARD-par med fyra Apaf-1 CARD-par som bildar det nedre ”lagret” medan tre eller fyra pc-9 CARD-par finns på den övre ytan (fig. 2b-d). Dessutom rör sig Apaf-1 CARDs längre bort från den centrala navets yta när de spiralerar uppåt på ett vänstervridet sätt och har därför olika konformationer av länkar och olika interaktioner med sina motsvarande NBD:er i det centrala navet. Apaf-1- och pc-9 CARD-paren interagerar genom typ II-gränssnitt och förenas lateralt runt spiralen främst genom typ I-interaktioner. Det är anmärkningsvärt att endast fyra av de sju Apaf-1 CARDs interagerar med pc-9 CARDs i skivan. Detta beror på att de återstående tre Apaf-1 CARD-molekylerna inte lätt passar in i spiralens bindningsmönster för underenheter och inte kan fortsätta spiralen eftersom deras CARD-NBD-länkare är för korta . Apaf-1 CARDs från intilliggande underenheter i apoptosomen finns vid en söm (mellan positionerna 1a och 7a), där spiralen slutar att sträcka sig vertikalt (fig. 2c, d) . Bildandet av Apaf-1/pc-9 CARD-skivan krävs för aktivering av apoptosomen och de katalytiska pc-9-domänerna är flexibelt bundna till CARD:erna genom en länk (fig. 2a) . I en struktur visualiserades en skiva med fyra Apaf-1 CARDs och tre pc-9 CARDs, med svag densitet som tyder på att en fjärde pc-9 CARD skulle kunna binda till toppen av den spiralformade spiralen vid en lägre beläggning . I en andra struktur innehöll den dominerande konfigurationen av skivan 8 CARDs och konformationen av CARDs i spiralen var mycket likartad mellan de två oberoende av varandra lösta strukturerna (se överlagring, fig. 2d). Variationer i pH och saltkoncentration kan förklara den olika beläggningen i den åttonde positionen. Apoptosomsammansättning främjar således rekrytering och lokal koncentration av pc-9 CARDs, vilket gör det möjligt att bilda en ny spiralformad oligomer med 7 eller 8 CARDs.

En nyligen genomförd analys (med MALS och SAXS) visade att bildandet av CARD-komplex är koncentrationsberoende och att lika stora mängder av Apaf-1 och pc-9 CARDs associeras som par genom det starkare typ I-gränssnittet, med ett dominerande 3:3-komplex som bildas vid hög koncentration i lösning . Detta CARD-komplex kristalliserades och strukturen bestämdes med 3,0 Ås upplösning för att avslöja en vänsterhänt spiral av tre Apaf-1/pc-9 CARD-par med en konformation som liknar den som observeras i apoptosomen men med vissa skillnader (PDB 5WVC; fig. 2e) . Miljön i kristallen är dock helt annorlunda än den som påträffas på den apoptosom som håller på att sättas samman, delvis på grund av gitterkontakter och avsaknaden av en kärnbildande yta med begränsningar som påtvingas av CARD-NBD-länkare. Detta kan förklara de observerade skillnaderna mellan de spiralformade CARD-strukturerna. Detta innefattar tillägget av en eller två extra CARDs till den skivliknande spiralen i holo-apoptosomen och fyra Apaf-1 CARDs som bildar basen av skivan, i stället för tre som man finner i lösning och i kristallen. Efter optimal anpassning av 8 CARD-skivan till 6 CARD-spiralen från kristallstrukturen finns det en god överensstämmelse mellan CARDs vid positionerna 2p, 3a och 4p, med en viss avvikelse i den senare halvan av 6 CARD-spiralen (fig. 2f, g). Särskilt Apaf-1 CARD i position 7a är felplacerad vertikalt till en mellanliggande position, i avsaknad av Apaf-1 CARD i position 1a (fig. 2g). Interaktioner mellan plattformen och CARD-skivan är således avgörande för att bilda kärnor till de större 7- och 8-CARD-spiraler som finns på apoptosomen.

Under monteringen av skivan kan spiralens kärnbildning ske på olika sätt, bland annat genom bildning av en CARD-heterotrimer som består av två Apaf-1 CARDs och en pc-9 CARD, där en Apaf-1 CARD är placerad vid spiralens bas (vid position 1a). Därefter kan två Apaf-1/pc-9 CARD-par läggas till som interagerar genom sina typ I-gränssnitt och i vissa fall slutar spiralen med en pc-9 CARD i position 8p. Andra permutationer är dock möjliga med tanke på den flexibla karaktären hos Apaf-1 CARD-NBD-linken, så att tre Apaf-1/pc-9 CARD ”typ I”-par kan bildas sekventiellt från det centrala navet, med tillägg av ett Apaf-1 CARD vid spiralens bas (i position 1a) under de tidiga faserna av sammansättningen . Det är viktigt att monteringen av skivan kan vara kooperativ för att bibehålla det korrekta avståndet mellan de fyra Apaf-1 CARDs på apoptosomen, som bildar spiralens bas .

För den aktiva apoptosomen är en stor skillnad uppenbar på det centrala navet, när man jämför de publicerade strukturerna (fig. 3 och 4) . I korthet är densitet som identifierats som en katalytisk domän av pc-9 (p20/p10) belägen på det centrala navet i en nyligen gjord 3D-kartläggning, och denna funktion visade sig vara närvarande i cirka 50 % av komplexen . Dessutom visualiserades en liknande täthet i en tidigare karta med lägre upplösning av holo-apoptosomen, vilket möjliggjorde en rimlig, om än preliminär dockning av p20/p10-underenheterna ; den observerade funktionen är alltså reproducerbar. Denna nya täthet har dock endast visualiserats med låg upplösning, vilket kan återspegla en viss flexibilitet i fastsättningen av p20/p10-underenheterna på det centrala navet. I en karta med nära atomupplösning som bestämdes av Yigong Shis grupp , löstes ytterligare en sickelformad täthet upp vid ~ 7 Å upplösning på det centrala navet, i anslutning till CARD-skivan. Denna täthet innehåller tydligt en ytterligare pc-9 CARD i centrum, som interagerar med två Apaf-1 CARDs på vardera sidan, på ett sätt som liknar det som observerats i två kristallstrukturer . Denna heterotrimera konfiguration kunde dock endast upplösas i ~ 10 % av partiklarna . Det verkar alltså som om experimentella förhållanden under provberedning och nätfrysning kan påverka hur pc-9 interagerar med potentiella bindningsställen på det centrala navet, inklusive bildandet av en skivliknande spiral med varierande antal pc-9 CARDs och i användningen av bindningsställen som är belägna i anslutning till den acentriska skivan. När de två senaste asymmetriska strukturerna av holo-apoptosomen anpassas utifrån deras CARD-skivor ligger de nya täthetstopparna på det centrala navet på helt olika platser (fig. 4). Medan den katalytiska pc-9-domänen (p20/p10) kan vara placerad på två ställen (med det mest sannolika i fig. 4c) , är den tre CARD-tätheten roterad och har en annan profil sett från sidan (visas inte), jämfört med den för den katalytiska pc-9-domänen (fig. 4b, d). Mönstret för Apaf-1 CARD-NBD länkartätheterna gör det möjligt att exakt kartlägga alla relevanta CARD-NBD-länkare i holoapoptosomen med tre CARD med sex ordnade Apaf-1 CARDs (fig. 4d) . Det är av avgörande betydelse att länkarnas längd (~ 25-30 Å) och deras relativa positioner kan utesluta att en modul med tre CARD-moduler binds till antingen position 1 eller 2 på det centrala navet. Det verkar alltså som om det finns flera platser på det centrala navet som kan utnyttjas på olika sätt för att binda en pc-9 CARD eller en katalytisk domän.

Procaspase-9 har uppskattats binda till apoptosomen med förhållanden mellan 2-5 zymogener per 7 Apaf-1-molekyler , så det verkar som om det exakta antalet pc-9-molekyler som är bundna till apoptosomen kan variera beroende på förhållandena under sammansättningen, vilket kan återspegla den dynamiska karaktären hos denna proteolytiska maskin. I förlängningen verkar det klart att en sjätte eller sjunde pc-9 CARD inte binds av sina Apaf-1 motsvarigheter, i förhållande till de platser som redan dokumenterats på apoptosomen, vilket kan återspegla antingen en sterisk begränsning eller behovet av en större oligomer för att stabilisera de bundna pc-9 CARD:erna. Viktigt är att vissa katalytiska pc-9-domäner inte syns i de nuvarande cryo-EM-täthetskartorna, på grund av deras flexibla fastsättning genom långa CARD-p20-linkers, vilket gör det svårt att dechiffrera och förstå de exakta aktiveringsmekanismerna, samtidigt som det framhäver ett behov av ytterligare studier av enstaka molekyler.

Apoptosomens primära funktion är att aktivera pc-9 så att den kan utföra apoptos. Medan strukturella studier har gett insikt i rekrytering och krav för aktivering av pc-9 har en rad biokemiska analyser nu visat att både proximitetsinducerad dimerisering och allosterisk reglering av monomer pc-9 är kritiska för att reglera apoptosoms funktion och kan också styra varaktigheten av apoptosoms aktivitet. För det första ökar rekryteringen av pc-9 av apoptosomen dess lokala koncentration för att möjliggöra homodimerisering, vilket ökar dess affinitet för komplexet . Intressant nog har en pc-9 som inte kan spaltas en högre benägenhet för homodimerisering och uppvisar en ökad proteasaktivitet (klyvning av caspase-3) inom apoptosomen, än vad klyvt caspase-9 gör. Följaktligen minskar klyvningen av den katalytiska domänens p20/p10-länk mellan underenheterna pc-9:s affinitet för apoptosomen, och när den väl har bearbetats frigörs caspase-9 och binder inte apoptosomen på nytt. Viktigt är att dessa studier har visat att homodimerisering av pc-9 är den nyckelhändelse som krävs för aktivering och att apoptosomen agerar för att underlätta denna händelse . Detta stämmer överens med biokemiska studier av andra CARD-kaspaser, t.ex. caspase-2 och Dronc, där den initiala aktiveringen kräver dimerisering snarare än klyvning av zymogenet . Stabilisering av pc-9-bindningen till apoptosomen kräver inte bara CARD-CARD-interaktioner, utan även interaktioner av pc-9:s lilla underenhet (p10) via dess GCFNF404-motiv för att bilda homo- och heterodimerer . Vad som inte är klart i nuläget är hur bildandet av pc-9 homodimer påverkar stabiliteten hos CARD-CARD-skivan, eftersom dimerer av den katalytiska domänen verkar vara ganska flexibla, eftersom de kan frigöras från holo-apoptosomen genom platsriktad trombinolys och inte är upplösta i cryo-EM-kartor som förfinats utan symmetri . GCFNF-motivet i pc-9 interagerar också med en Apaf-1 NOD för att bilda pc-9/Apaf-1-heterodimerer som effektivt klyver caspase-3 . Dessa data tyder på att en katalytisk domän hos pc-9, som interagerar direkt med apoptosomen, kan vara aktiv. Denna förmodade aktiva plats för klyvning av caspas-3 kan motsvara den nya täthet som observerats på det centrala navet och som har tolkats som en p20/p10-molekyl och ytterligare studier behövs på denna punkt. Sammantaget tyder dessa resultat på att pc-9 kan ha två olika aktiva konformationer inom apoptosomen, med en eller möjligen två homodimerer bundna till CARD-skivan och en pc-9/Apaf-1-heterodimer bunden till det centrala navet . När holoapoptosomer med tre CARD-moduler bundna till det centrala navet tas med i beräkningen är minst sex permutationer möjliga för dispositionen av tre till fem katalytiska pc-9-domäner (fig. 5). Antalet möjliga aktiva katalytiska pc-9-domäner (som homodimerer och heterodimerer) kommer således att variera beroende på antalet pc-9-molekyler som rekryteras till apoptosomen, eftersom de fyller möjliga bindningsställen som förmedlas av Apaf-1 CARDs.

För det sista, fullständig klyvning av pc-9 av caspase-3 avlägsnar länkern mellan underenheterna och återställer full caspase-9-aktivitet, vilket tyder på att caspase-3 också har en proteolytisk återkoppling på pc-9 som kan förstärka den apoptotiska signalen . En liknande mekanism har föreslagits för caspase-2 . Dessa biokemiska studier har vidare presenterat en molekylär timermodell där hastigheten för dissociation av caspase-9 från apoptosomen bestäms av en inledande klyvning av p20-p10-linken, vilket minskar dess bindningsaffinitet till apoptosomen . En fullständig dissociation av klyvt caspas-9 från holoapoptosomen skulle dock kräva att dess CARD frigörs från skiv- eller tre CARD-modulen. Det kan alltså finnas en hierarki för frisättning av aktiva caspas-9-molekyler som beror på den lokala miljön för deras CARDs. Utformningen av CARD-skivan, med alla pc-9 CARDs placerade på den övre ytan, kan också underlätta frisättningen av caspase-9.