PEG Utfällning: Ett kraftfullt verktyg för rening av monoklonala antikroppar

Metoden för pelletsfångst visade sig ha en betydande inverkan på renheten hos den återupplösta produkten. Fällningssteget är lätt skalbart och passar en helt engångsbaserad process i efterföljande led.

Percivia LLC

Ansträngningar pågår för att identifiera alternativ till kromatografi med packad bädd för att minska tidsåtgången och kostnaden för behandling av produktströmmar med högtiter. Även om många ansträngningar är inriktade på membranadsorberare som direkt ersätter kolonner med samma eller liknande kemikalier, börjar vissa äldre tekniker vinna terräng vid tillverkning av rekombinanta proteiner. Ett attraktivt alternativ till kromatografi är utfällning, som har använts inom plasmaproteinindustrin i många år.1 En enkel metod för utfällning innebär att processvätskan titreras till den isoelektriska punkten för det protein som ska fällas ut.2 Lyotropa salter, t.ex. ammoniumsulfat, har också en lång historia av användning i fällningsprocesser.3 Kortkedjiga fettsyror, t.ex. kaprylsyra, är välkända för sin förmåga att fälla ut DNA och värdcellsproteiner (HCP).4 Polyjoniska arter är också användbara fällningsmedel för att fånga upp en produkt av intresse eller för att avlägsna förorenande proteiner.5,6

Polyetylenglykol (PEG) har använts för fällning av produkter och föroreningar.7,8 Det kan också kombineras med isoelektrisk fällning för att förbättra separationens effektivitet.9,10 Efter fällningen kan centrifugering eller filtrering användas för att utföra fast-vätskeseparation.11 Även om centrifugering är en väletablerad metod för att åstadkomma denna separation, kan det vara problematiskt att tvätta produktpelletsen för att avlägsna föroreningar, och den lämpar sig inte för en engångsprocess. Filtrering – normalt eller tangentiellt flöde – kräver mer utveckling, men det är enklare att tvätta pelletsen och den kan lätt anpassas till en process för engångsbruk.

I detta arbete utvecklades ett produktutfällningssteg med hjälp av PEG för att återvinna en monoklonal antikropp (MAb) från klarade PER.C6-cellkulturmedier. Lämpliga fällningsförhållanden identifierades genom användning av fullfaktoriella experimentella konstruktioner. Två filtreringssteg utvärderades för att fånga upp och tvätta den fällda produkten, och den överlägsna metoden skalades upp 10 gånger. Den totala fällningsprocessen resulterade i en avkastning på cirka 90 % och en HCP-reduktion på 1 LRV utan någon signifikant ökning av aggregatnivån för det återupplösta MAb. Slutligen undersöktes hur utfällningssteget påverkar det efterföljande steget med katjonbytesinfångning (CEX).

Material och metoder Reagenser

USP-kvalitetssalter, Tween 20, saltsyra, ättiksyra och natriumhydroxid köptes från JT Baker (Phillipsburg, NJ). PEG var av reagenskvalitet och köptes från JT Baker eller EMD Chemicals (Gibbstown, NJ). Alla buffertar bereddes med MilliQ-vatten (Millipore, Billerica, MA) och filtrerades med 0,22 µm-filter före användning.

Feedstock

En mänsklig MAb (IgG1, pI = 8,3, 150 kDa) producerades vid Percivia, LLC med hjälp av en PER.C6-cellinje. PER.C6-cellerna är mänskliga embryonala retinaceller som immortaliserats med adenovirus E1-genen, enligt beskrivningen i det amerikanska patentet 5 994 128.12 Cellerna odlades i en standardiserad fed-batch-process eller XD-processen, som båda använder kemiskt definierade medier.13,14 Fed-batch-medierna klargjordes genom sedimentering och djupfiltrering, och XD-medierna klargjordes med hjälp av ECS-metoden (Enhanced Cell Settling) följt av djupfiltrering.15 Under ECS användes Silica-PEI-harts för att förbättra cellnedläggningen och även minska DNA och HCP.

Optimering av fällningsbetingelser

Villkoren som användes för att fälla MAb – PEG-molekylvikt, PEG-koncentration och pH – optimerades genom fullfaktoriell experimentell design med hjälp av programvaran Minitab (State College, PA). pH-värdet i det klarade XD-mediet justerades till önskad nivå med 2-M Tris i ett koniskt rör på 15 ml. PEG tillsattes som en 40 % (w/w) stamlösning till önskad slutkoncentration. Röret centrifugerades sedan vid 1 000 g och supernatanten dekanterades. Slutligen löstes pelletsen upp på nytt i fosfatbuffrad saltlösning (PBS).

Pelletsinfångning genom djupfiltrering eller mikrofiltrering

Djupfiltrering utfördes med olika kvaliteter av filtermedia. Millistak+HC D0HC, C0HC och X0HC köptes från Millipore Corp. (Billerica, MA), och ZetaPlus 60SP02A köptes från Cuno (Meriden, CT). Utfällningen utfördes med hjälp av en 40 % (w/w) stamlösning av PEG-3350 och det utfällda mediet fylldes på med ett matningsflöde på 50 L/m2 /h tills allt material fyllts på eller tills transmembrantrycket (TMP) var 15 psid. Filtren tvättades sedan med 20-30 L/m2 av 20 mM Tris pH 8,5 + 14,4 % (w/w) PEG-3350. Efter tvättning passerade 80 L/m2 resolubiliseringsbuffert genom filtren vid 100 L/m2 /h, och permeatet recirkulerades genom anordningen vid 600 L/m2 /h tills A280-värdet i permeatpoolen var stabilt, vilket tyder på fullständig upplösning av MAb. Slutligen återställdes eventuell kvarhållen produkt med en buffertspolning på 20 L/m2 och luftblåsning av filtermodulen. I vissa tester tvättades filtermediet därefter med 85-mM acetat, pH 5,3, följt av 1-M NaCl. Tryck- och flödesdata samlades in med hjälp av ett specialkonstruerat system från ARC Technology Services (Nashua, NH).

Mikrofiltrering utfördes med ett 0,22-µm hålfibermembran från GE Healthcare Life Sciences (Piscataway, NJ). PEG-3350 tillsattes som en 40 % (w/w) stamlösning för det småskaliga experimentet och i pulverform för uppskalningsarbetet. Matningsflödet var 710 L/m2 /h och retentatet och permeatet var obegränsade. Utfällningen koncentrerades först 10-14 gånger och tvättades sedan med tre diafiltrationsvolymer av 20 mM Tris pH 8,5 plus 14,4 % (w/w) PEG-3350. Slutligen löstes utfällningen upp på nytt i 85 mM natriumacetat pH 5,3 eller 20 mM Tris plus 50 mM NaCl pH 7,5. Tryck-, flödes- och konduktivitetsdata samlades in med hjälp av ett Slice 200 bänkbordssystem (Sartorius, Gottingen, Tyskland) för småskalig testning och ett SciPro-system (SciLog, Middleton, WI) för uppskalningsexperimentet.

Kationbyteskromatografi

Toyopearl GigaCap S-650 anskaffades från Tosoh Bioscience (Montgomeryville, PA) i Toyoscreen 5-mL-format. Detta harts har tidigare visat sig vara ett högkapacitetsfångststeg för MAbs.16 Kolonnen ekvilibrerades med 74-mM natriumacetat pH 5,3 och laddades till 90-95 mg-MAb/mL-harts med hjälp av antingen förtydligat media eller förtydligat och PEG-behandlat material, var och en justerad till samma pH och konduktivitet som ekvilibreringsbufferten. Kolonnen tvättades sedan med ekvilibreringsbuffert och antikroppen eluerades med 50 mM natriumacetat pH 5,3 plus 90 mM NaCl.

Analytisk teknik

Koncentrationen av MAb i mediainnehållande prover bestämdes med analytisk Protein A HPLC (Applied Biosystems, Foster City, CA). Aggregatnivåerna mättes genom storleksexklusionskromatografi (SEC) med hjälp av en TSKgel G3000SWXL-kolonn från Tosoh Bioscience (Montgomeryville, PA), med toppdetektion genom UV-absorption vid 280 nm. HCP-nivåerna kvantifierades med en PER.C6-specifik ELISA från Cygnus Technologies (Southport, NC). SDS-PAGE utfördes med NuPAGE 4-12 % Bis-Tris-geler och färgning gjordes med SimplyBlue SafeStain, båda från Invitrogen (Carlsbad, CA).

Resultat och diskussion Fällningsbetingelser

För båda molekylvikterna av PEG, 3 350 och 6 000 Da, var PEG-koncentrationen den dominerande faktorn för återvinningen och renheten hos det återupplösta MAb. Fällning med PEG-3350 resulterade i den högsta återvinningen (figur 1). Den högre återvinningen skedde dock på bekostnad av en högre HCP-belastning i det återupplösta MAb. När det gäller aggregerat MAb var nivåerna inte signifikant annorlunda än utgångsmaterialet, men det bör noteras att det särskilda MAb som används i detta arbete inte är benäget att bilda aggregat. Förbättringen av HCP-reduktionen genom användning av PEG-6000 uppvägdes av det minskade produktutbytet. Det slutliga villkoret som valdes var 14 % (w/v) PEG-3350 (motsvarande 14,4 % w/w) och pH 8,5.

Figur 1

Fångst av pellets genom djupfiltrering

I det första försöket fälldes ECS-klarerade XD-medier och pelletsen fångades upp genom djupfiltrering med X0HC-medier. Ingen väsentlig ökning av transmembrantrycket (TMP) observerades under belastningen av 361 g-MAb/m2 (data visas inte). Efter tvättning gjordes resolubilisering av den immobiliserade pelleten med 85 mM acetat pH 5,3. Även efter recirkulation i 2 timmar hade antikroppen inte lösts upp helt och hållet, så 0,1 % v/v Tween 20 tillsattes till resolubiliseringsbufferten. Efter ytterligare 30 minuters resolubilisering var MAb helt upplöst.

Tabell 1. Avkastning och avlägsnande av föroreningar för PEG-fällningsoperationen med hjälp av djupfiltrering med X0HC för att återvinna produkten

Massbalansdata sammanfattas i tabell 1. HCP-reduktionen var lägre än i det tidigare försöket (figur 1), där endast 5 000 ppm HCP fanns i den slutliga poolen jämfört med 8 300 ppm i detta försök. Vissa djupfilter är dock kända för att ha hydrofoba och anjonbytande (AEX) adsorberande egenskaper.17 Det utfällda mediet laddades vid ett relativt högt pH (8,5) och låg konduktivitet (<10 mS/cm), vilket kan ha inducerat bindning av sura proteiner på en AEX-matris. Dessutom har det visat sig att proteinbindningskapaciteten hos jonbytesmatriser ökar i närvaro av PEG.18,19 Därför är det troligt att en del av de HCP:er som fanns kvar i lösningen efter utfällningen bundit till djupfiltermediet och eluerats ut i produkten under resolubiliseringen. Denna hypotes stöds också av skillnaden i HCP-innehållet i utfällningens supernatant och djupfiltrets genomströmning (9 900 jämfört med 240 mg), vilket tyder på att djupfiltret avlägsnar HCP från lösningen. Efter immobilisering av antikroppen på djupfiltret återupplöstes den vid ett betydligt lägre pH (5,3), vilket resulterade i att bundet HCP eluerades och att slutproduktens renhet minskade. Detta fenomen skulle kunna mildras genom att använda mindre adsorptiva djupfiltermedier, t.ex. Millistak+HC D0HC/C0HC och ZetaPlus SP-filter som 60SP02A, eller genom att återlösa produkten i en buffert med låg salthalt och högre pH-värde, t.ex. 20-mM Tris pH 7,5.

Figur 2

Dessa strategier testades genom att man laddade utfällda fed-batch-medier på D0HC-, C0HC-, X0HC- och 60SP02A-filter. Alla filter tvättades på samma sätt med PEG/Tris-buffert, men resolubiliseringen gjordes med 20 mM Tris pH 7,5 plus Tween 20 för Millipore-filtren och 85 mM acetat pH 5,3 plus Tween 20 för Cuno-filtren. Millipore-filtren strippades också med en buffert med lågt pH (85 mM acetat pH 5,3) och högt salt (1 M NaCl) efter det att produkten återfanns för att avgöra om eventuella bundna HCP:er kunde elueras. Figur 2 visar att alla testade filter var kraftigt nedsmutsade. Eftersom fed-batch-mediet inte klarades med ECS-metoden, som har visat sig avsevärt minska DNA-nivåerna i XD-skördar, kan det finnas mer DNA närvarande, som fälls ut i höga PEG-koncentrationer.20 Det högre DNA-innehållet i utfällningen kan ha minskat filterkapaciteten, men detta har inte undersökts. Tabell 2 visar att vart och ett av experimenten resulterade i en bättre HCP-reduktion (84-88 % jämfört med 46 %), och även om HCP-bördan i utgångsläget var högre (49 000 ppm jämfört med 13 000 ppm) hade de återupplösta MAb-poolerna generellt sett lägre HCP-innehåll (6 000-7 800 ppm jämfört med 8 300 ppm). Användningen av filter med låg adsorptionsförmåga och återupplösning i en buffert med högre pH-värde tycks lösa problemet med HCP som elueras från djupfiltermediet. SDS-PAGE av strippfraktionerna visade att både HCP och produkt var bundna till filtren – inklusive de mindre adsorptiva D0HC- och C0HC-filtren – och bekräftade att X0HC-medierna var mer adsorptiva än D0HC- och C0HC-medierna (figur 3).

Tabell 2. Avkastning och avlägsnande av föroreningar vid PEG-fällning med djupfiltrering med olika filtermedier för att återvinna produkten

Pelletsfångst genom mikrofiltrering

Även om HCP-belastningen av det återupplösta MAb minskade genom att använda en buffert med högre pH och mindre adsorberande djupfiltermedier, var djupfiltrens kapacitet låg för fed-batch-medier (<400 g-MAb/m2 ). Mikrofiltrering (tangentialflödesfiltrering, MF TFF) testades i syfte att förbättra kapaciteten med den extra fördelen att kunna använda vilken buffert som helst för resolubilisering på grund av den låga bindningsegenskapen hos den ihåliga fibern. Den hydrauliska prestandan för MF TFF-koncentration och tvättning av utfällning i matad batch visas i figur 4. Permeatflödet var cirka 100 L/m2 /h och TMP låg mellan 1,0 och 2,5 psid under hela verksamheten. Massbelastningen på 475 g-MAb/m2 var bättre än den som uppnåddes i någon av djupfiltreringarna. Produktåtervinningen och HCP-reduktionen var båda omkring 90 %, vilket är något bättre än vad som uppnåddes vid djupfiltrering (tabell 3).

Figur 3

Resolubiliseringen var mycket enklare och snabbare än för djupfiltreringen; i stället för att recirkulera bufferten genom anordningen pumpades bufferten genom insidan av lumenerna in i retentatkärlet med permeatkärlet stängt och lät sig blandas i cirka 60 minuter. Detta var tillräckligt för att lösa upp antikroppen på nytt, och inga hjälpämnen behövdes. På grund av svårigheten att lösa upplösningen med djupfiltrering återupplöstes produkten vid eller nära koncentrationen i matningsmediet. Den slutliga poolen från MF TFF-processen var nästan två gånger mer koncentrerad än utgångsmaterialet.

Figur 4

Då retentatet och permeatet var öppna för atmosfäriskt tryck krävdes minimal instrumentering: en tvärströmspump, en trycksensor och en överföringspump för diafiltrationen. Kombinationen av hög kapacitet, hög återvinning och HCP-clearance samt enkel drift gör MF TFF till ett föredraget alternativ för pelletsfångst jämfört med djupfiltrering. Utfällningen och MF TFF-steget skalades upp 10 gånger till en 0,12 m2 stor hålfiberanordning, och prestandan var jämförbar med den lilla skalan (tabell 4).

Tabell 3. Avkastning och avlägsnande av föroreningar vid PEG-fällning med mikrofiltrering för att återvinna produkten i bänkskala

Kationsbyteskromatografi

Kationsbyteskromatografi med hög kapacitet (CEX) utvärderades med flöden som förbehandlats med eller utan PEG-fällning. Utfällningssteget hade ingen signifikant inverkan på stegutbytet eller den procentuella minskningen av HCP, men eluatet från det utfällda laddningsmaterialet innehöll sju gånger mindre HCP (tabell 5).

Tabell 4. Avkastning och avlägsnande av föroreningar för PEG-fällning med användning av mikrofiltrering för att återvinna produkten i pilotskala

Slutsatser

Fällning har länge använts inom plasmaproteinindustrin för att rena proteiner i stor skala. Tekniken har här anpassats till den inledande MAb-reningen från klarade fed-batch- och XD-medier på ett skalbart sätt. Två filtreringssteg för engångsbruk har utvecklats för att fånga upp och tvätta den utfällda produkten, vilket eliminerar behovet av centrifugering. Det visades att utfällningsoperationen inte påverkade utbytet av CEX-fångststeget negativt och att den minskade HCP-innehållet i eluatet med en faktor sju.

Tabell 5. Avkastning och HCP-avlägsnande för GigaCap S-650 laddad med fällda (+PEG) och icke-fällda (âPEG) antikroppar

Förmågan att minska föroreningsbördan så långt uppströms i reningskedjan är nyckeln till att förkorta processen nedströms eller ersätta traditionell kromatografi med annan teknik för engångsbruk. Lägre föroreningsbörda kan förbättra belastningskapaciteten hos flödesmembranadsorberare och eventuellt virusfilter, som i allmänhet är mycket dyra objekt i en process.

En ytterligare fördel är möjligheten att återupplösa antikroppen i en buffert som underlättar den efterföljande enhetsoperationen. Till exempel kräver cellodlingsmedier vanligtvis omfattande titrering och utspädning eller ett UF-DF-steg för att förbereda för fångstkromatografi med en katjonbytare. Här kan den utfällda antikroppen lösas upp i ekvilibreringsbuffert i hög koncentration, vilket förkortar behandlingstiden. Detta kan vara viktigt för produkter som inte tål långvarig exponering för förhållanden med lågt pH/konduktivitet. I fallet med just denna antikropp kräver det klarade mediet en mer än tvåfaldig utspädning för att laddas på en CEX-kolonn, medan det omlösta MAb kan laddas direkt med nästan två gånger så hög koncentration som det ojusterade mediet. Detta är minst en fyrfaldig minskning av laddningsvolymen, vilket kan leda till betydande tidsbesparingar för moderna CEX-hartser med hög kapacitet.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Percivias protein- och analysvetenskap för assaystöd i detta arbete och Percivias uppströms processutvecklingsgrupp för leverans av cellodlingsmedier.

Märkesanteckning

PER.C6 är ett registrerat varumärke som tillhör Crucell Holland BV Corporation, XD är ett registrerat varumärke som tillhör DSM NV och ECS är ett registrerat varumärke som tillhör DSM NV. Alla andra varumärken är varumärken som tillhör respektive ägare.

MICHAEL KUCZEWSKI är forskare I, EMILY SCHIRMER, PhD, är forskare II, BLANCA LAIN, PhD, är senior forskare och GREGORY ZARBIS-PAPAPASTOITSIS, PhD, är senior direktör, alla inom processutveckling i efterföljande led, Percivia LLC, Cambridge, MA, 617. 301.8821, [email protected]@percivia.com

1. Cohn EJ, Strong LE, Hughes WL, Mulford DJ, Ashworth JN, Melin M, et al. Preparation and properties of serum and plasma proteins. IV. Ett system för separation i fraktioner av protein- och lipoproteinkomponenterna i biologiska vävnader och vätskor. J Amer Chem Soc. 1946;68(3):459-75.

2. Van der Wielen L, Hofland G, Ottens M, Gulobovic M, Witkam G-J. Tillverkning av proteinbaserade strukturer med hjälp av en flyktig syra. I: 224th National Meeting of the American Chemical Society. Boston, MA; 2002.

3. Habeeb A, Francis R. Framställning av humant immunglobulin genom ammoniumsulfatfällning. Vox Sanguinis. 1976;31:423-34.

4. Wang J, Diehl T, Aguiar D, Dai X-P, Arunakumari A. Utfällning av processrelaterade föroreningar i reningsmetoder för antikroppar som inte är protein A. BioPharm Int. 2009 Oct suppl, Downstream Processing 2010: Embracing Innovation;4-10.

5. McDonald P, Victa C, Carter-Franklin JN, Fahrner R. Selective antibody precipitation using polyelectrolytes: En ny metod för rening av monoklonala antikroppar. Biotechnol Bioeng. 2009;102(4):1141-51.

6. Moya W, Jaber J, Moya W, uppfinnare; Millipore Corp, förvärvare. Rening av proteiner. USA-patent US WO/2008/079280. 2006.

7. Polson A, uppfinnare; South African Inventions Development Corporation, mottagare. Fraktionering av blandningar av proteinhaltiga ämnen med hjälp av polyetylenglykol. Förenta staternas patent US 3415804. 1968.

8. Giese G. Polyetylenglykolfällning av monoklonala antikroppar och inverkan på kolonnkromatografi. I: BioProcess Int. Raleigh, NC; 2009.

9. Thrash S, Otto J, Deits T. Effect of divalent ions on protein precipitation with polyethylene glycol: mechanism of action and applications. Proteinuttryck och rening. 1991;2(1):83-9.

10. Ramanan S, Stenson R, Ramanan S, uppfinnare; Amgen, mottagare. Metod för isolering av antikroppar genom utfällning. Förenta staternas patent US 2008/0214795 A1. 2008 2/13/08.

11. Venkiteshwaran A, Heider P, Teysseyre L, Belfort G. Selective precipitation-assisted recovery of immunoglobulins from bovine serum using controlled-fouling crossflow membrane microfiltration. Biotechnol Bioeng. 2008;101(5):957-66.

12. Fallaux FJ, Hoeben RC, Eb AJvd, Bout A, Valerio D, Fallaux FJ, Hoeben RC, uppfinnare; IntroGene B.V, förvärvare. Förpackningssystem för humant rekombinant adenovirus för användning i genterapi. USA-patent US 5994128. 1997.

13. Golden K, Bragg C, Chon J. XD-processen: utveckling av en högtiterprocess för PER.C6-celler. I: 21st Meeting of the European Society of Animal Cell Technology. Dublin, Irland; 2009.

14. Chon J. Framsteg i produktionsprocesserna för plattformen fed-catch och XD med användning av den mänskliga cellinjen PER.C6. Wilbio Waterside Conference; 2009 Apr 20-22; South San Francisco, CA.

15. Schirmer EB, Kuczewski M, Golden K, Lain B, Bragg C, Chon J, et al. Primary clarification of extreme-density cell culture harvests by enhanced cell settling. Bioprocess Int. 2010;8(1):32-9.

16. Lain B, Cacciuttolo MA, Zarbis-Papastoitsis G. Development of a High-Capacity MAb Capture Step Based on Cation-Exchange Chromatography. Bioprocess Int. 2009;7(5):26-34.

17. Yigzaw Y, Piper R, Tran M, Shukla AA. Utnyttjande av djupfiltrens adsorptiva egenskaper för avlägsnande av värdcellsprotein vid rening av monoklonala antikroppar. Biotechnol Prog. 2006;22:288-96.

18. Milby KH, Ho SV, Henis JMS. Jonbyteskromatografi av proteiner: effekten av neutrala polymerer i den rörliga fasen. J Chromatogr. 1989;482:133-44.

19. Gagnon P, Godfrey B, Ladd D. Metod för att erhålla unika selektiviteter i jonbyteskromatografi genom tillsats av organiska polymerer till den rörliga fasen. J Chromatogr A. 1996;743:51-5.

20. Paithankar KR, Prasad KS. Utfällning av DNA med polyetylenglykol och etanol. Nucleic Acids Research.1991;19(6):1346.