PLOS ONE
Diskussion
Majoriteten av kemoterapeutiska läkemedel är specifikt utformade för att störa DNA-syntesen, cellmetabolismen och celldelningen. På grund av detta verkningssätt förväntas dessa läkemedel orsaka flera typer av mutationer . Mutagenicitet hos kemoterapeutiska läkemedel för normala celler är ett av de allvarligaste problemen inom kemoterapi på grund av möjligheten att framkalla sekundära maligniteter och onormala reproduktionsresultat som Down-, Klinefelter- och Turners syndrom. Det är därför absolut nödvändigt att fastställa den mutagena effekten av kemoterapeutiska läkemedel på normala celler. Mikronukleustestet har använts i stor utsträckning för att mäta icke reparerade skador på arvsmassan, och en ökad MN-frekvens förutsäger risken för cancer hos människor . Eftersom MN kan resultera från kromosombrott (klastogenicitet) eller eftersläpande kromosomer (aneugenicitet) har upptäckten av MN potential att användas som en screening för numerisk kromosomavvikelseinduktion om tester som tillåter identifiering av hela kromosomer inuti MN, såsom FISH-testet, inkluderas.
Epirubicins klastogena aktivitet under mitos in vivo rapporterades genom MN-testet i benmärg . För närvarande har ursprunget till den epirubicininducerade MN ännu inte fastställts. Därför utformades den aktuella studien för att undersöka epirubicinets förmåga att inducera aneuploidi i somatiska och germinala celler hos hanmöss. För att fastställa metodens effektivitet användes två modellmutagener, colchicin och mitomycin C, som är kända för att ha aneugena respektive klastogena verkningar, som positiva kontroller. De observerade resultaten av MNPCE och fördelningen av signaler per MN i kontrollen och de två positiva mutagenerna i den aktuella studien stämmer väl överens med de publicerade uppgifterna , . Dessa data bekräftade känsligheten hos det experimentella protokoll som följdes vid detektion av genotoxiska effekter.
Resultaten av MN-testet har visat att epirubicin ger dosberoende ökningar av MN-bildningen i musens benmärg in vivo (fig. 1) och en ökning av centromeriskt negativa och centromeriskt positiva färgade MN, vilket tyder på induktion av både klastogenicitet och aneugenicitet (fig. 2). Både epirubicinets klastogena och aneugena potential i somatiska celler kan ge upphov till utveckling av sekundära tumörer. Resultaten av klastogeniciteten bekräftar resultaten från tidigare in vivo-studier, där ökningar av MN-bildning och strukturella kromosomavvikelser i somatiska celler hos mus över ett liknande dosintervall observerades efter behandling med epirubicin . Resultaten av dessa studier stämmer också överens med den tidigare rapporterade mikronukleusinduktionen av epirubicin i murina cancerceller in vitro , i erytrocyter från inkuberade hönsägg och i den humana lymfoblastoida TK6-cellinjen . Dessutom har man tidigare rapporterat om induktion av strukturella och numeriska kromosomavvikelser hos cancerpatienter som fått epirubicininnehållande kemoterapi . Tidigare studier har också visat att epirubicin inducerar strukturella kromosomavvikelser i odlade HeLa-celler , både strukturella och numeriska kromosomavvikelser och systerkromatidbyten i en kinesisk hamstercellinje , samt kromosomavvikelser i perifera blodlymfocytkulturer från kvinnor med bröstcancer som behandlats med en epirubicininnehållande behandling in vitro .
Studier på människor har visat att vissa kemoterapieregimer ökar frekvensen av aneuploidi i könsceller , , vilket tyder på att sådana patienter kan löpa högre risk för onormala reproduktionsresultat, särskilt i de reproduktiva åldrarna. Därför är det av allmänt intresse att minska risken för produktion av aneuploidi, upptäcka aneugens i könsceller och förstå orsaksmekanismerna. I den aktuella studien bestämdes aneuploidi i könsceller med hjälp av sperm-FISH-analysen med DNA-sonder som är specifika för musens kromosomer 8, X och Y, var och en märkt med en annan färg. För att fastställa metodernas tillförlitlighet användes colchicin, som är känt för att vara övervägande aneugeniskt, som positiv kontrollsubstans, och resultaten av den positiva och negativa kontrollen låg inom samma intervall som i tidigare studier , -. Dessa data bekräftade känsligheten hos det experimentella protokollet när det gäller att upptäcka aneuploidogena effekter av de testade föreningarna.
Epirubicin är mest aktivt i cellcykelns S- och G2-faser; det har dock en viss påvisbar aktivitet i alla faser av cellcykeln . Det har ofta rapporterats att kemikalier med aneugena egenskaper kan förändra celldelningens progression i både meiotiska och mitotiska celler . I den aktuella studien bedömdes utvecklingstiden från meiotiska divisioner i spermatocyter till epididymala spermier med hjälp av BrdU-incorporationsanalysen. Resultaten visar tydligt att epirubicin förlängde varaktigheten av meiotiska delningar i spermatocyter av mus under 48 timmar (fig. 3). Dessa observationer bekräftar därför tidigare resultat att epirubicininducerad hämning av topoisomeras II-funktionen under olika faser av cellcykeln fördröjer cellcykelutvecklingen och får cellerna att stanna i G2/M-fasen . Ett sådant G2/M-arrest kan bero på induktion av G2-kontrollpunktsmaskineriet, vilket gör det möjligt att reparera skadat DNA innan cellerna går vidare till nästa cellcykelstadium .
Den in vivo-information som finns om epirubicins effekter på icke-diskonstruktion under meiosen är begränsad, men vissa andra antracykliner, t.ex. doxorubicin och dess derivat idarubicin, förhindrar kromosomsegregation och inducerar betydande ökningar av frekvensen av disomiska och diploida spermier . Dessutom visade en in vitro-studie att behandling av kinesiska hamsterkulturer med epirubicin inducerade numeriska aberrationer i form av hypodiploidi och hyperdiploidi . Dessutom visade flödescytometrisk och histologisk analys av spermatogenesen hos mus en ökning av variationskoefficienten i DNA-histogrammet som ett mått på aneuploidi, och en ökning av antalet diploida spermatider efter behandling med epirubicin . I överensstämmelse med de ovan citerade rapporterna visade det föreliggande experimentet att exponering för epirubicin orsakade betydande dosberoende ökningar av frekvensen disomiska och diploida spermier och att induktionen av aneuploidi var linjärt dosresponsiv mellan 0 och 12 mg/kg epirubicin (fig. 4). Dessa in vivo-observationer är också i linje med en tidigare in vitro-rapport om humana lymfocyter odlade från friska individer och cancerpatienter där doxorubicin-exponering orsakade en ökning av trisomier av kromosomerna 7 och 17 . Vidare rapporterade Ganapathi et al. att mänskliga leukemiceller HL-60 som har monosomi 8 som enda karyotypiska förändring fick 7q21-markörer efter exponering för doxorubicin. Dessutom visade cytogenetiska fynd trisomi 8 hos patienter som fick systemisk kemoterapi med antracyklin . Monosomi 7, 7q- och obalanserad translokation inklusive kromosom 7 observerades hos patienter som fick kemoterapi innehållande antracykliner . Dessutom har strukturella kromosomavvikelser i kromosomerna 1, 9 och 16 relaterats till kemoterapeutiska läkemedel som innehåller antracyklin .
Av andra klasser av topoisomeras II-hämmare har etoposid tidigare studerats i spermatocyter från mus , . Resultaten av dessa studier tyder på att etoposid fungerar som ett genotoxiskt medel och inducerar aneuploidier i främst meiotiska könsceller efter behandling av pachytenceller. Å andra sidan fann Kallio och Lähdetie, att känsligheten för etoposid hos möss var störst under diploten-diakinesen av primära spermatocyter, minskad under sena pachyten och låg under preleptotena stadier; ett mycket annorlunda mönster än med DNA-alkylerande kemikalier. Dessa författare föreslog att etoposid orsakade en misslyckad upplösning av rekombinerade kromosomarmar, troligen i samband med cellcykelstopp och utlösning av den apoptotiska vägen. I sina detaljerade cytogenetiska studier rapporterade Marchetti et al. att pachytene var det känsligaste stadiet i spermatogenesen för induktion av strukturella kromosomavvikelser och aneuploidi. Eftersom uppgifterna från Schmid et al. och Kallio och Lähdetie kunde visa att etoposid förlängde den meiotiska cellcykeln, verkar det möjligt att de effekter som Marchetti et al. såg i de första klyvningsdivisionerna i 24,5-dagars parningsgruppen i själva verket kan ha inducerats i ett senare skede, dvs. under meiotisk diakinesis, MMI eller MMII istället för pachytene som författarna föreslog.
I den aktuella studien planerade vi sperm-FISH-studie för att avgöra om subakut behandling med låga doser av topoisomeras II-hämmaren epirubicin skulle ha en effekt eftersom tidigare profasstadier skulle inkluderas i epirubicinbehandlingen. Enskilda doser av 0,25, 0,5 och 1 mg/kg epirubicin injicerades under 12 på varandra följande dagar, och spermaprov togs 23 dagar efter den sista behandlingen med epirubicin. En total dos av 12 mg/kg epirubicin som applicerades under hela meiosens profas ökade signifikant frekvensen av disomiska och diploida spermier, medan en total dos av 3 och 6 mg/kg doxorubicin var negativ (fig. 5). Däremot gav en engångsdos på 6 mg/kg epirubicin applicerad på spermatocyter under MMI/MMII ett positivt resultat (fig. 4). Dessa data tyder på att tidigare profasstadier bidrar relativt mindre till epirubicininducerad aneuploidi i manliga könsceller.
I den aktuella studien konstaterades att epirubicin orsakade märkbara ökningar av autodiploida spermier (XX88 och YY88). Efter behandling med epirubicin var autodiploida spermier till följd av stopp i MMII vanligare än diploida spermier till följd av stopp under MMI (XY88). Således var den andra meiotiska divisionen känsligare för epirubicinbehandling än den första meiotiska divisionen. Slutsatsen att den andra meiotiska divisionen var känsligare för epirubicinbehandling än den första meiotiska divisionen stöds också av de observerade frekvenserna av disomiska könskromosomer. Spermier med signaler av XX8 eller YY8 var vanligare än spermier med signaler av XY8. Dessa observationer bekräftar att spermie-FISH-analysen för disomi eller diploidi kan upptäcka effekter som inducerats under båda de meiotiska delningarna och att man kan jämföra känsligheten för båda de meiotiska delningarna, som tidigare rapporterats , .
I denna spermie-FISH-analys fann man att den lägsta positiva dosen för att orsaka disomiska eller diploida spermier var 6 mg/kg epirubicin. MN-studier av benmärg i mus visade dock att exponering för 3 mg/kg epirubicin gav en signifikant ökning av MNPCE. Denna observation tyder på att MN i benmärg framkallas vid lägre doser än disomier eller diploidier i spermier. Därför är benmärgen den känsligare vävnaden. Testerna mäter dock olika slutpunkter. Kromosomförlust och kromosombrott mäts i MN-testet, och icke-diplomering upptäcks i spermie-FISH-testet. Dessa uppgifter bekräftar därför det allmänna paradigmet för riskbedömning, enligt vilket ett positivt resultat av MN-testet i benmärg är en indikator på en förenings genotoxiska potential i könsceller. Kvantifiering av aneuploidi i könsceller är dock viktig för riskbedömning.
DNA-topoisomerashämmare har en tydlig tendens att orsaka dubbelsträngade DNA-brott, vilket främst resulterar i bildandet av centromernegativa MN . På samma sätt tyder demonstrationen av att epirubicin är en effektiv topoisomeras II-hämmare på att epirubicin framkallar sina klastogena effekter genom denna mekanism. Metaboliter av epirubicin kan också aktivera cellerna för att öka den intracellulära produktionen av reaktiva syrearter, av vilka de stabila och diffusa formerna kan skada kärn-DNA . Om de cellulära reparationsmekanismerna är överbelastade kan primära DNA-skador leda till strukturella eller numeriska kromosomavvikelser och så småningom orsaka tumörer . Detta förslag stöds av det faktum att personer som utvecklade en andra malign neoplasm efter behandling av en första malign neoplasm hade en sämre förmåga att reparera DNA-dubbelsträngsbrott än de som inte utvecklade en andra malign neoplasm, vilket mättes med γH2AX-intensitet . Induktionen av centromerpositiva MN av epirubicin tyder på att det kan finnas en annan mekanism genom vilken epirubicin inducerar sin genotoxiska effekt. Denna observation understryker vikten av att använda FISH-modifieringen av MN-analysen för att fastställa ursprunget till de inducerade MN. Den potentiella mekanism genom vilken epirubicin kan utöva sin aneugena effekt är genom hämning av topoisomeras II, vilket kan leda till felfördelning av kromosomer under celldelningen. Detta beror på att DNA-topoisomeras II är nödvändigt för att systerkromatiderna ska kunna separeras korrekt under celldelningen, och att det i dess frånvaro förekommer både icke-diskonstruktion och brott. Således kan epirubicin eventuellt hämma två nyckelroller för topoisomeras II; dess förmåga att korrekt segregera nyligen replikerade kromosomer samt dess funktion att återligga övergående dubbelsträngade DNA-brott.
Sammanfattningsvis, genom att använda FISH-analys med en centromerisk DNA-sond för erytrocyt MN, visades att epirubicin inte bara är klastogent utan även aneugeniskt i somatiska celler in vivo. Med hjälp av BrdU-inkorporeringsanalysen visades att den meiotiska fördröjningen orsakad av epirubicin var ungefär 48 timmar. Med spermie-FISH-analysen visades att epirubicin inducerar aneuploidier under meiosen som resulterar i disomiska spermier samt fullständigt meiotiskt stopp som skapar diploida spermier. Förekomsten av autodiploida (XX88, YY88) och disomiska (XX8 eller YY8) spermier tyder på att den andra meiotiska divisionen är känsligare för epirubicin än den första meiotiska divisionen. Resultaten tyder också på att tidigare profasstadier bidrar relativt sett mindre till epirubicininducerad aneuploidi. Både epirubicinets klastogena och aneugena potential kan ge upphov till utveckling av sekundära tumörer och onormala reproduktionsresultat hos cancerpatienter och medicinsk personal som utsätts för läkemedelsregimer som innehåller epirubicin. Även om epirubicin har mindre systemisk toxicitet och hjärttoxicitet än doxorubicin och andra antracykliner med ett likvärdigt spektrum av antitumörverkan , har det aneuploidogena och cytotoxiska effekter i icke-tumörceller. Denna aneuploidogena effekt av läkemedlet kan vara ansvarig för uppkomsten av onormala reproduktionsresultat och sekundära tumörer, som uppmärksammas hos vissa cancerpatienter någon gång efter framgångsrik behandling av deras primära cancer med epirubicininnehållande kemoterapi.