Samband mellan HPV-genotyper och externa anogenitala vårtor: en tvärsnittsstudie

Studieutformning och deltagare

En tvärsnittsstudie med ett icke-probabilistiskt urval har genomförts. Patienter som besökte dermatologikliniker vid Farwania Health District Area rekryterades till studien konsekutivt från november 2016 till maj 2017. Immunokompetenta patienter med tidigare klinisk diagnos av externa anogenitala vårtor som planerades för kryoterapi eller laserbehandling ombads underteckna samtyckesblanketten efter en muntlig förklaring från dermatologen som bad dem delta. Vid provtagningstillfället samlades vårtproverna in i universellt transportmedium (HealthLink Inc., Copan Italia S.p.A., Italien) och förvarades vid – 80 °C. Etiskt godkännande erhölls från Health Sciences Center Ethical Committee (nummer: VDR/EC/2310) och hälsoministeriet.

Demografisk och klinisk information togs från varje patient, inklusive: De kliniska och medicinska uppgifterna om varje patient togs fram: ålder (år), kön (man, kvinna), nationalitet (kuwaitisk, icke-kuwaitisk), antal vårtor (en, två till fyra och minst fem), varaktighet för förekomsten av vårtor (< en månad, en till sex månader, sju till tolv månader och mer än tolv månader), storleken på varje vårta (i centimeter) (< en, en, mellan en och två, mer än två), partner har vårtor (ja, nej) och om vårtorna har varit föremål för tidigare behandling (ja, nej). Ingen av deltagarna fick HPV-vaccinering, eftersom HPV-vaccinering ännu inte har genomförts i Kuwait, även om genomförandet för närvarande diskuteras vid hälsoministeriet.

DNA-extraktion och kontroller

Mottagna vävnadsprover förvarades vid – 80 °C. På grund av det stora antalet mottagna prover hackades alla vårtor per patient ihop och utsattes för en DNA-isolering. Vävnad hackades med steril sax och tång på en petriskål och cirka 25 mg vävnad vägdes. Vävnaden tvättades i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och överfördes till Eppendorfrör på 1,5 ml. Genomiskt DNA extraherades från vävnadsproverna med hjälp av ett QIAmp DNA Mini-kit (Qiagen, USA) enligt tillverkarens anvisningar.

HPV typ 2, HPV typ 1 och HPV typ 16-vektorer (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) användes som kontroller i PCR-experimenten.

Real time PCR

Det realtids-PCR-assayet utfördes för att screena för HPV-DNA i genitala vårtor. Fem mikroliter (5-μl) av det extraherade DNA:t kombinerades med 12,5-μl av 2X Syber Green master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) som innehåller ROX som en passiv referens och 10 pmol framåt- och bakåtriktade primers (10-uM, beskrivs nedan). Alla uppsättningar av primers var specialtillverkade av Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA. Blandningen fylldes upp till 25-μl volym med nukleasfritt vatten (Ambion, Austin, TX, USA). För att minska antalet falska positiva eller negativa resultat analyserades proverna i två exemplar på en reaktionsplatta med 96 optiska brunnar (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Positiva och negativa kontroller ingick i varje amplifieringssats. För att kvantifiera HPV i proverna utfördes en fem- till tiofaldig serieutspädning av det kända positiva kontroll-DNA:t tillsammans med proverna. PCR-amplifiering i realtid utfördes i ABI 7500 realtids-PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

PCR-analysen i realtid utfördes på tre olika plattor. Den första plattan användes för att bestämma mål-DNA:s integritet genom β-globin PCR-analys, genom att amplifiera ett målfragment på 268 bp, enligt vad som tidigare beskrivits av Lum och Le Marchand 1998 . Nukleotidsekvensen för β-globinprimerna är följande: PCR-primer för β-globin framåt: 5′-TGGGTTTCTGATAGGCACTGACT-3′. β-globin reverse PCR-primer: 5′-AACAGCATCATCAGGAGGAGTGGACAGAT-3′. PCR-amplifieringen inleddes vid 95 °C i tio minuter och avslutades med 45 amplifieringscykler (denaturering vid 95 °C i 15 s, glödgning vid 55 °C i 45 s och förlängning vid 65 °C i en minut).

Den andra plattan användes för att screena för förekomst av HPV-infektion med hjälp av MY11/GP6-primers från HPV L1 ORF . Nukleotidsekvenserna för MY11/GP6-primerna är följande: MY11 forward primer: 5′- GCM CAG GGW CAC AAY AAT GG -3′ och GP6 reverse primer: 5′- GAAAAATAAAAACTGTAAATCATATATTC-3′. Den förväntade storleken på det amplifierade fragmentet är 185 bp. PCR-amplifieringen inleddes vid 95 °C i tio minuter och avslutades med 45 amplifieringscykler (denaturering vid 95 °C i 15 s, glödgning vid 45 °C i 45 s och förlängning vid 65 °C i en minut).

Den tredje plattan användes för att undersöka förekomsten av HPV-infektion med hjälp av HVP2/B5-primrar från HPV L1 ORF . Nukleotidsekvenserna för HVP2/B5-primerna är följande: HVP2-premiär: 5′- TCN MGN GGN CAN CCN YTN GG -3′; B5-premiär: 5′- AYN CCR TTR TTR TTR TGN CCY TG -3′. Den förväntade storleken på det amplifierade fragmentet är 650 bp. PCR-amplifieringen inleddes vid 95 °C i tio minuter och avslutades med 45 amplifieringscykler (denaturering vid 95 °C i 15 s, glödgning vid 50 °C i 45 s och förlängning vid 65 °C i en minut).

Fluorescensspektrum registrerades under förlängningsfasen i varje PCR-cykel. Sequence Detection Software (SDS v1.7) i ABI 7500 realtids-PCR användes för att generera amplifieringskurvan för varje reaktion. En dissociationskurva genererades efter varje reaktion för att skilja mellan specifika och ospecifika amplikoner. På grundval av amplifieringskurvan valdes alla prover med HPV-amplifiering som startade vid vilken cykel som helst och upp till cykelnummer 40 (med en gränslinje på 0,2) ut för analysen. Endast prover med en dissociationskurva mellan 70 °C och 80 °C och med ett derivatvärde mellan 0,100-0,500 betraktades som HPV-DNA-positiva.

Sanger-sekvensering

HPV-DNA i vårtor amplifierades genom nested PCR före sekvensering, med hjälp av AmpliTaq Gold Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) HVP2/B5-primers användes i den första PCR:n och CN1F/CN1R, CN2F/CN2R, CN3F/CN3R och C4F/C4R-primers i den andra PCR:n. Den första PCR-amplifieringen inleddes vid 95 °C i tio minuter och avslutades med 35 amplifieringscykler (denaturering vid 95 °C i 15 s, glödgning vid 50 °C i 45 s och förlängning vid 68 °C i en minut). Den andra PCR-amplifieringen utfördes med 3 μl av den första PCR-produkten och samma cykelförhållanden. De förväntade HPV-genotyper med brett spektrum som ska detekteras från kutana vårtor med hjälp av HVP2/B5 och CN1F/CN1R, CN2F/CN2R, CN3F/CN3R och C4F/C4R-primrar omfattar HPV-typer från genera alfa (HPV 2, 3, 7, 10, 27, 28, 29, 40, 43, 57, 77, 91 och 94), gamma (HPV 4, 65, 95, 48, 50, 60 och 88), mu (HPV 1 och 63) och nu (HPV 41) .

PCR-produkterna renades med hjälp av ett PCR-rensningskit (NucleoSpin Extract II PCR Purification Kit, Macherey-Nagel GmbH & Co.KG, Düren, Tyskland) enligt tillverkarens anvisningar. De utsattes sedan för Sanger-sekvensering med hjälp av BigDye terminator v3.1 cycle sequencing mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) och de nested PCR-primers som beskrivs ovan. PCR-rening efter sekvensering utfördes för att avlägsna obundna fluorescerande deoxyterminatorer med hjälp av BigDye XTerminator™ Purification kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Proverna denaturerades i 2 minuter vid 95 °C och kyldes omedelbart på is och laddades i en ABI 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Proverna elektroforeserades på en 50 cm kapillärmatris med POP 6-polymer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) som separationsmedium.

Proverna analyserades med hjälp av programvaran Sequencing Analysis v 3.7 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). HPV-sekvensanpassningen utfördes med sekvenser som presenteras i GenBank-databasen med hjälp av BLASTn-programvaran (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) och Los Alamos Data National Laboratory Theoretical Biology and Biophysics HPV-databasen (https://pave.niaid.nih.gov/).

När de erhållna sekvenserna var av dålig kvalitet på grund av lågt utbyte av PCR-produkter klonades PCR-produkterna in i pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, WI) efter rening med Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System-kit (Promega), och sekvensering av inlagorna utfördes med hjälp av M13 forward och reverse primers.

Statistisk analys

Data om den kliniska diagnosen, demografiska data och virologisk analys tabellerades och analyserades med hjälp av statistikprogrammet SPSS ”Statistical Package for Social Sciences, SPSS version 25.0” (IBM Corp, Armonk, NY, USA). Beskrivande statistik: frekvenser/procent, mått på centrum och spridning beräknades. För att testa likhet mellan medelvärden användes t-testet med två stickprov för alla kontinuerliga variabler när normalitet förelåg, annars användes Mann Whitney U-testet. För att jämföra medelvärden för tre grupper användes antingen variansanalys eller Kruskal-Wallis-test, beroende på vilka antaganden som uppfylldes. Pearson chi square-test för oberoende eller Fisher exact-test användes för att testa sambanden mellan två kategoriska variabler när antagandena var uppfyllda. För att modellera ett binärt utfall med en uppsättning kovarianter tillämpades logistisk regression, och råa och justerade oddskvoter och deras 95-procentiga konfidensintervall uppskattades. Alla tester var tvåsidiga och ett P-värde på mindre än 5 % ansågs vara statistiskt signifikant.