Specifika antikroppar behöver specifik validering

En av de mest använda verktygen inom biomedicinsk forskning är den monoklonala antikroppen. Dessa proteiner har potential att söka upp och binda till ett önskat mål och kan användas för cellbildtagning, cellsortering, immunoassays och många andra tillämpningar.

Men dessa arbetshästar i laboratoriet fungerar inte alltid som de ska. Beroende på målets karaktär kan en antikropp vara inkonsekvent i vissa tester – den kan till exempel binda till fel mål och ge falskt positiva resultat. Med tanke på den utbredda användningen av antikroppar inom forskningen är detta ett potentiellt miljardproblem.

Ett viktigt mål är att utveckla strategier för validering av antikroppar så att forskarna kan lita på att en antikropp är lämplig för deras särskilda behov – och att deras resultat kommer att vara reproducerbara.

Thermo Fisher Scientific har utvecklat en tvådelad plattform för validering av antikroppar för att testa inte bara specificiteten hos sina InvitrogenTM-antikroppar (att de binder till rätt mål), utan också deras lämplighet för olika tillämpningar. Samma test är dock inte lämpligt för alla antikroppar: Thermo Fisher använder ett lämpligt test för varje proteinmål, beroende på dess biologiska funktion. Vissa antikroppar testas bäst genom att använda CRISPR-Cas9 för att slå ut den gen som kodar för målproteinet och kontrollera att antikroppen inte längre binder till något. Andra antikroppar kan testas med hjälp av immunutfällning följt av masspektrometri för att kontrollera att de är bundna till rätt mål.

Thermo Fisher utvecklar och förfinar test för validering av antikroppar baserat på målantigenets biologiska funktion. Här är två fallstudier av specifika proteiner och deras specificitetstester.

Knock-outs för cancer

Den epidermala tillväxtfaktorreceptorn (EGFR) är ett välstuderat protein: dysreglering i EGFR-systemet är inblandat i olika cancerformer. För att testa om antikroppar är specifika för EGFR eller för något av dess mål i nedströmsledet kan forskarna slå ut kritiska proteiner i EGFR-banan och se hur den antikroppsbindande signalen förändras.

Under de senaste åren har CRISPR-Cas9-systemet blivit känt som det mest tillförlitliga och kraftfulla sättet att slå ut en gen. Detta gör det idealiskt för att testa antikroppsspecificitet inom en signalkaskad. Thermo Fisher-forskarna tog en vanlig mänsklig karcinomlinje (A-431) och använde en western blot för att få en baslinje för bindningssignalen. De använde sedan CRISPR-Cas9 för att eliminera målgenen och skapa EGFR-knockouts. Ett western blot av protein som extraherats från dessa knockout-celler visade att det inte längre fanns någon signal för ett målprotein (figur 1).

Fortsatta tester bekräftade resultatet. Signaleringskaskaden nedströms EGFR omfattar proteiner som RAS, RAF, MEK och ERK. Aktivering av EGFR med epidermal tillväxtfaktor (EGF) leder till fosforylering av dessa nedströmsproteiner, som kan detekteras med hjälp av andra antikroppar som känner igen dessa fosforylerade tillstånd. Att tillsätta EGF till EGFR-knockoutcellerna bör dock inte leda till någon nedströmsfosforylering. Tillsats av samma antikroppar som känner igen fosforylerade mål gav inga signaler. Thermo Fisher-forskarna är därför övertygade om att anti-EGFR-antikroppen är målspecifik.

En rad modifikationer

I cellkärnan är DNA tätt paketerat – lindat runt histonproteiner för att bilda kromatin. Det är svårt att studera histoner eftersom de kan påverkas av ett antal kemiska förändringar, så kallade posttranslationella modifieringar (PTM). Rester på ett histon kan till exempel få en eller flera metyl-, acetyl- eller fosforylgrupper, som var och en har en effekt på cellfunktionen.

Vissa tekniker, t.ex. kromatinimmunutfällning (ChIP), western blotting, immunofluorescens och immunohistokemi, använder antikroppar mot specifika PTM:er i histonet för att förstå tillståndet hos histonet och dess bindning. Flera histonmodifieringar har dock liknande DNA-bindningsmönster; en antikropp som inte har testats noggrant mot alla histon-PTPM:er kan binda till fel typ och ge ett falskt positivt resultat.

Thermo Fisher testade sina histon-PTPM-specifika antikroppar med hjälp av en rad peptider med en mängd olika PTM:er. Om en antikropp verkligen är specifik för en PTM kommer den endast att binda till de fläckar som bär denna PTM. Thermo Fisher-forskarna mätte signalerna med hjälp av en specificitetsfaktor: den genomsnittliga intensiteten av alla fläckar som innehåller en viss PTM dividerad med den genomsnittliga intensiteten av alla fläckar utan PTM (figur 2). Antikropparna uppvisade en 4- till 190-faldigt högre specificitetsfaktor för sitt PTM-måltillstånd än för icke-måltillstånd, vilket ger förtroende för att de är mycket selektiva.

Thermo Fisher har sju andra specificitetstester utöver genetisk knock out och peptidmatriser. Dessa inkluderar användning av RNAi för att slå ut genuttryck, en differentiellt upphöjd antikropp för att oberoende verifiera målinriktning och naturligt förekommande variabelt uttryck för att bekräfta specificitet. Endast genom sådana noggranna och rigorösa tester kan forskarna vara säkra på att deras arbetshästar i laboratoriet är lämpliga för ändamålet – och att deras arbete klarar av den noggrannaste granskning.

Hitta tillämpningsanvisningar om dessa antikroppar från Invitrogen och mer om Thermo Fisher Scientifics tvådelade testmetod här.