Teknik för förgrenat DNA (bDNA)

BY admin
|

Introduktion

Den förgrenade DNA-analysen (bDNA) är ett unikt och kraftfullt verktyg för tillförlitlig kvantifiering av nukleinsyramolekyler. Den bDNA-analysen skiljer sig i grunden från målamplifieringsmetoder som PCR och mäter direkt nukleinsyramolekyler på fysiologiska nivåer genom att förstärka reportersignalen, i stället för att replikera målsekvenser som detektionsmedel, och undviker därmed de fel som är inneboende i extraktion och amplifiering av målsekvenser. bDNA-analysen använder sig av linjär signalförstärkning med hjälp av syntetiska oligonukleotidprober och bDNA-molekyler och kan mäta mellan cirka 500 och 10 000 000 molekyler på ett korrekt och exakt sätt. Nya framsteg inom bDNA-tekniken omfattar tillägg av förförstärkarmolekyler och inkorporering av nya nukleotider, isoC och isoG, i oligonukleotiska sondsekvenser för att ytterligare förstärka signalen och minska det brus som orsakas av ospecifik hybridisering av bDNA-analysens komponenter. Dessa förbättringar har förlängt den kvantitativa detektionsgränsen för bDNA-analysen till så lågt som 50 molekyler.

Historia för bDNA-tekniken

Bedömd för rutinanvändning i en klinisk miljö eller forskningsmiljö har bDNA-analysen tillämpats med framgång på ett antal områden, bland annat för prognos och övervakning av patienter med virussjukdomar. bDNA-analyser har utvecklats för att mäta DNA från hepatit B-virus, RNA från hepatit C-virus, RNA från humant immunbristvirus typ 1 och DNA från cytomegalovirus och utgör ett tillförlitligt sätt att direkt kvantifiera virusbelastningen i kliniska prover. Med specialanpassad utformning av oligonukleotidprober sträcker sig de potentiella tillämpningarna av bDNA-analysen långt bortom kvantifiering av virala nukleinsyror. Genom att skapa oligonukleotidprober för specifika sekvenser av målnukleinsyramolekyler har bDNA-analysen anpassats till en mängd olika tillämpningar. Forskare har t.ex. konstruerat prober för bDNA-analysen för att mäta cellulära mRNA-nivåer. Detta har visat sig vara ett fruktbart tillvägagångssätt för ett antal forskningstillämpningar, inklusive övervakning av förändringar i cytokinernas mRNA-nivåer i friska och immunsupprimerade patientpopulationer, undersökning av insulinspliceringsmönster och utvärdering av induktion av stressgener för tillämpningar inom molekylär toxikologi. Med tanke på dess mångsidighet, användarvänlighet och höga prestanda är bDNA-analysen snabbt på väg att bli den mest populära metoden för kvantifiering av nukleinsyror

Outline

BDNA-analysen använder sig av ett mikroplattformat med 96 brunnar och bygger på en serie specifika hybridiseringsreaktioner och kemiluminiscensdetektion av hybridiserade prober. På ytan av varje mikrocell finns ”fångstprober” som innehåller en specifik nukleotidsekvens. Dessa prober binder till en delmängd ”målprober” som är bundna till specifika nukleotidsekvenser i målnukleinsyramolekylen. Genom denna serie hybridiseringar förankras målnukleinsyramolekylen till mikrocellsytan. Detektion av målnukleinsyran och förstärkning av signalen sker genom ytterligare en serie hybridiseringar.

En andra delmängd målprober binder målnukleinsyramolekylen till bDNA-förstärkarmolekyler. Genom att lägga till förförstärkarmolekyler för att ge ett ytterligare förstärkningslager mellan målproberna och bDNA-förstärkarmolekylerna kan en ännu större signalförstärkning uppnås. Varje bDNA-förstärkarmolekyl har utformats för att innehålla 15 armar, som var och en innehåller tre bindningsställen för alkalisk fosfatas-konjugerade ”etikettprober”. En kemiluminiscent signal genereras när ett dioxetansubstrat introduceras som aktiveras av det alkaliska fosfataset. Denna signal kan enkelt kvantifieras genom att räkna antalet fotoner som avges i en luminometer. bDNA-analysen är i sig kvantitativ eftersom antalet fotoner som avges är direkt relaterat till mängden målnukleinsyra i provet.

Material

Utrustning – Chiron plattvärmare utrustad med 8×12 mikropåsehållare – Chiron plattläsningsluminometer

Reagens för dag 1

  • Oligonukleotid-modifierade mikroskålar
  • Lysförtunning
  • Lysreagens (proteinas K)
  • Målsonder för infångning
  • Målsonder för märkning
  • Provtagningar
  • Standarder och kontroller (valfritt)

Reagens för dag 2

Förfarande

Dag 1

  1. Förbered arbetsreagens för prov genom att kombinera:
  • 6 ml spädningsvätska för analys
  • 600 ml lysireagens
  • 32 ml 500 fm/ml målprober för infångning (20 fm/200 ml slutlig)
  • 96 ml500 fm/ml målprober för märkning (60 fm/200 ml slutlig)

Anmärkning: De faktiska koncentrationerna av målproberna kommer att variera beroende på målnukleinsyramolekylen.

  1. För plasma- eller serumprover, pipettera 150 ml Specimen Working Reagent och 50 ml serum eller plasma i duplicerade oligonukleotidmodifierade mikroceller. För cell- eller vävnadsprover, förbered och extrahera RNA-pellets i Specimen Working Reagent enligt beskrivningen och pipettera 200 m av varje RNA-extrakt i duplicerade oligonukleotidmodifierade mikrobrunnar.
  2. Om så önskas kan positiva och negativa kontroller inkluderas för specificitetsändamål. Kontrollerna bör behandlas på samma sätt som beskrivs för proverna i steg 2 (ovan) och körs i två exemplar.
  3. Om så önskas kan standarder inkluderas för absolut kvantifiering. Pipettera 150 ml av Specimen Working Reagent och 50 ml av lämplig standardkurva medlem i duplikat oligonukleotidmodifierade mikroceller.
  4. Segla mikrocellerna med Mylar-film och inkubera mikrocellerna över natten vid 53 °C i Chirons plattvärmare. (Anmärkning: Temperaturen beror på den definierade optimala temperaturen för den specifika analysen.)

Dag 2

  1. Ta bort plattan från Chiron-plattvärmaren och låt den stå 10 min vid rumstemperatur. Medan plattan svalnar förbereder du förstärkarlösningen genom att späda ut förstärkarkoncentratet på 200 fm/ml i etikettutspädningsvätska. Slutkoncentrationen bör vara 10 fm/50 ml.
  2. Tvätta mikrobrunnarna två gånger med Wash A och pipettera sedan 50 ml utspädd förstärkare i varje brunn. Inkubera mikrobrunnarna i 30 min vid 53 °C i Chiron-plattvärmaren.
  3. Ta bort plattan från Chiron-plattvärmaren och låt den stå 10 min i rumstemperatur. Medan plattan svalnar förbereder du etikettarbetslösningen genom att späda ut etikettsonden med 500 fm/ml i etikettutspädningsvätska. Slutkoncentrationen bör vara 20 fm/50 ml.
  4. Tvätta mikrobrunnarna två gånger med Wash A och pipettera sedan 50 ml av etikettarbetslösningen i varje brunn. Inkubera mikrobrunnarna i 15 minuter vid 53 °C i Chiron-plattvärmaren.
  5. Ta bort plattan från Chiron-plattvärmaren och låt den stå 10 minuter i rumstemperatur. Under denna tid förbereder du substratlösningen som består av 99,7 % v/v LumiphosPlus och 0,3 % v/v 10 % SDS (till exempel: 3 ml LumiphosPlus, 9 ml 10 % SDS).
  6. Tvätta mikrovågsskålarna två gånger med Tvätt A och sedan tre gånger med Tvätt B. Tillsätt 50 ml av substratlösningen i varje brunn.
  7. Mät kemiluminiscensen i den plattläsande luminometern. (Detta inkluderar inkubation av mikrobrunnarna i 30 minuter vid 37 °C före mätning för att nå steady-state kinetik).

Felsökning

  • Oligonukleotidmodifierade brunnar ska hanteras med försiktighet. Bryt inte sönder brunnsremsor i segment. Försegla brunnarna ordentligt med en ny plattförseglare för att förhindra avdunstning under inkubationerna. När du tar bort plattförseglaren efter inkubationer, var försiktig så att brunnarna inte dras ut ur microwellhållaren.
  • Alla prover, standarder och kontroller bör analyseras i två exemplar för optimal kvantifiering. A void lipemiska eller grumliga prover eftersom dessa kan ge ofullständiga resultat.
  • För optimala resultat ska alla reagenser föras till den temperatur som anges i analysförfarandet före användning. Tillsätt reagens till mikrobrunnarna genom att vidröra pipettspetsen mot väggen nära brunnens mittpunkt, ovanför ytan av vätskan i brunnen.

Användning

Viral kvantifiering eller testning av virusbelastning har blivit en del av rutinhanteringen av patienter som är infekterade med hiv-1- eller hepatit C-virus (HCV). Det finns för närvarande flera molekylära tekniker som är tillgängliga för användning i det kliniska laboratoriet. Av dessa är det endast tester med förgrenat DNA (bDNA) som är FDA-godkända för testning av viral belastning av hiv-1 och HCV. Denna signalförstärkningsteknik bygger på en serie hybridiseringsreaktioner som i hög grad lämpar sig för fullständig automatisering och därmed minskar den arbetsinsats som krävs för att utföra denna typ av analys.

Molekylärdiagnostiska tester som använder bDNA-teknik för detektion av nukleinsyra-målmolekyler är känsliga, specifika och tillförlitliga verktyg för att diagnostisera virus- och bakterieinfektioner och för att övervaka sjukdomsutvecklingen under behandlingens gång. bDNA-tester har utvecklats från utvecklingsstadier i forskningslaboratoriet till kvantitativa tester som godkänts av den amerikanska läkemedelsmyndigheten Food and Drug Administration och som har värdefulla kliniska tillämpningar. bDNA-testerna är mindre arbetsintensiva än många molekylärbaserade förfaranden eftersom de i hög grad lämpar sig för total automatisering. Vid användning av bDNA krävs ingen amplifiering av en målsekvens, och därför är korskontaminering mellan replikatprover på grund av överdrivna amplikoner eller överföring mindre sannolik i bDNA-analyser. Eftersom bDNA är en signalförstärkningsteknik kan analysen dessutom kvantifiera med mindre än 0,5 log eller 3-faldig variabilitet för hela det dynamiska området.

bDNA-tekniken har visat sig vara mångsidig eftersom metoder har utvecklats för att detektera infektion av ett stort antal mikroorganismer, inklusive parasiten Trypanosoma

brucei, cytomegalovirus, antibiotikakänsliga och antibiotikaresistenta Staphylococcus-bakterier, humant papillomavirus och hepatit B-virus. På senare tid har man dock fokuserat på utvecklingen av bDNA-analyser för kvantifiering av hiv-1- och hepatit C-virus (HCV)-RNA, vilket har lett till rutinmässig tillämpning av bDNA-metoder i laboratoriet för klinisk molekylärdiagnostik. Vid beskrivningen av utvecklingen av bDNA-metoderna betonas i denna översikt bDNA-analyser för hiv-1 och HCV.

Första generationens bDNA-analyser för hiv-1

Precisa, reproducerbara bDNA-analyser av första generationen utvecklades för att detektera hiv-1 RNA och HCV RNA i mänsklig plasma (Quantiplex HIV-1 eller HCV RNA 1.0 assay, Bayer, Tarrytown, NY).9-11 I en av de första rapporterna om Quantiplex bDNA-analysen observerades ingen reaktivitet med plasmaprover från seronegativa donatorer med hjälp av den första generationens

bDNA-analys, vilket tyder på utmärkt specificitet.9 Positiva resultat i bDNA-analysen observerades i 83 % av proverna från 348 patienter som var seropositiva för hiv-1.9 Det dynamiska intervallet för kvantifiering med Quantiplex HIV-1 RNA 1.0-analysen sträckte sig från 104 (nedre detektionsgräns) till mer än 106 hiv-RNA-kopior/mL.9,11 Förändringar i virusbelastning på 2-3 gånger var statistiskt signifikanta med hjälp av bDNA-testet, vilket tyder på att Quantiplex HIV-1 RNA 1.0-analysen var mycket noggrann och reproducerbar.11 Som jämförelse krävdes förändringar i virusbelastning på minst 3,7-5,8 gånger för att resultaten skulle bli statistiskt signifikanta med hjälp av de tidigaste versionerna av RT-PCR-analysen.11 Därför blev bDNA den metod som valdes för de flesta kliniska prövningar som utvärderade testning av virusbelastning och den kliniska effekten av nya hiv-1 omvänt transkriptas och proteashämmare.

Känsligheten hos bDNA-detektionsmetoden förbättrades i andra generationens hiv-1-assay (Quantiplex HIV-1 RNA 2.0-assay, Bayer) genom att ändra utformningen av mål- och fångstproberna och genom att lägga till förförstärkaroligonukleotider. Den förbättrade utformningen av mål- och fångstproberna gjorde det möjligt att öka hybridiseringens stränghet och därmed minska testbakgrunden. Förförstärkare ökar signalintensiteten dramatiskt eftersom varje förförstärkarmolekyl har flera regioner för hybridisering till många bDNA-molekyler. Dessutom har varje bDNA-molekyl flera upprepade sekvenser för hybridisering av AP-märkta prober. Signalen från Quantiplex HIV-1 RNA 2.0-analysen visade linjäritet från cirka 500 kopior/mL till 1,6 × 106 kopior/mL (det angivna dynamiska området var 500 till 8 × 105 kopior/mL). Känsligheten hos andra generationens hiv-1 bDNA-test ökade med 20 gånger jämfört med första generationens test (nedre detektionsgränsen var 500 kopior/mL respektive 10 × 104 kopior/mL). I en omfattande analys av precisionen jämfördes de första testresultaten och resultaten av omtestningen av Quantiplex HIV-1 RNA 2.0-analysen. Testet HIV-1 RNA 2.0 visade sig vara mycket reproducerbart.14 Av 174 prover med en virusbelastning på mer än 5 000 kopior/mL hade 96 % skillnader på mindre än 0,3 log10 i antalet kopior mellan de ursprungliga resultaten och resultaten från omtesterna. Av 69 prover med viruslaster mellan 500 och 5 000 kopior/mL hade 86 % skillnader på mindre än 0,3 log10 mellan de första resultaten och omtestresultaten. Bland 5 339 patienter som testades i rutinmässiga kliniska tester under ett 1-årsintervall observerades dock viruslaster på mindre än 500 kopior/mL i 41,6 % av proverna.

Därmed behövdes en bDNA-analys med högre känslighet (dvs. nedre detektionsgräns på <500 kopior/mL) för en betydande andel av patienterna.

Den prestanda som kännetecknar Quantiplex HIV-1 RNA 2.0-analysen och ett RT-PCR-test (Amplicor HIV-1 Monitor 1.0 assay, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) jämfördes med hjälp av utspädningar av standardprover som hade känt antal kopior av HIV-1-virus. När utspädningar av samma standarder testades i de två testerna var antalet hiv-1-kopior i allmänhet högre i RT-PCR-analysen än i bDNA-analysen. Till exempel var intervallerna för antalet RNA-kopior 900-7,68 × 105 kopior/mL i bDNA-testet och 3 360-1,88 × 106 kopior/mL i RT-PCR-testet. Båda testerna var linjära för de angivna dynamiska områdena.

En jämförelse av lutningarna av regressionslinjerna för hiv-1-kopieringsantalet i förhållande till signalutgången tyder på att bDNA-testet hade ett mindre proportionellt systematiskt fel. Variabiliteten mellan olika körningar, med användning av ett standardprov med 1 650 hiv-1 kopior/mL, var lägre för bDNA-testet än för RT-PCR-testet. Variationskoefficienterna för bDNA- och RT-PCR-testet var 24,3 % respektive 34,3 %, vilket tyder på att bDNA-testet var något mer exakt vid detta hiv-1 RNA-kopieringsnummer. Jämfört med att använda standarden på 1 650 kopior/ml var variationskoefficienterna mellan körningar högre för ett prov som innehöll 165 hiv-1 RNA-kopior/ml (44,0 % och 42,0 %).7 % för bDNA- och RT-PCR-analyserna). Testresultaten var likartade när lika många hiv-1-kopior jämfördes mellan hiv-subtyperna A till F med hjälp av bDNA-testet. Med denna version av RT-PCR upptäcktes dock subtyperna A, E och F mindre effektivt än subtyperna B, C och D. Skillnaderna mellan andra generationens bDNA-test och Amplicor Monitor RT-PCR-testet för hiv-1-kvantifiering visade att det krävdes en konsekvent testmetod för varje enskild patient under hela diagnosen och behandlingen.

HCV bDNA-test

Samtidigt som Bayer fortsatte att utveckla ett förbättrat bDNA-test för hiv-1 av tredje generationen insåg man att det fanns ett behov av att utveckla ett HCV-viralbelastningstest med en begynnande klinisk användbarhet som liknar den för hiv-1-testning. För detektion av HCV hade den första generationens bDNA-test (Quantiplex HCV RNA 1.0 assay, Bayer) ett dynamiskt kvantifieringsområde i human plasma från 3,5 × 105 till 1,2 × 108 HCV RNA-kopior/mL. Genotyperna 1 till 6 detekterades med hjälp av detta test, även om känsligheten var lägre för genotyperna 2 och 3 (67 % detektionsgrad: positiv signal för 60 av 89 serumprover som man visste innehöll HCV-genotyperna 2 eller 3) jämfört med genotyp 1 (97 % detektionsgrad: positiv signal för 67 av 69 serumprover som man visste innehöll HCV-genotyp 1). En jämförelse mellan Quantiplex HCV RNA 1.0-analysen och ett RT-PCR-test för HCV som utvecklats av ett forskningslaboratorium visade att RT-PCR-testet var känsligare och hade en nedre detektionsgräns på 2,5 × 104 HCV RNA-kopior/mL. HCV bDNA-testet hade dock större reproducerbarhet och var mindre tidskrävande än det laboratorieutvecklade RT-PCR-testet för HCV.

För att förbättra detektionsfrekvensen för HCV-genotyperna 2 och 3 utvecklades ett test av andra generationen (Quantiplex HCV RNA 2.0 assay, Bayer).15 Den viktigaste förändringen av utformningen av andra generationens HCV RNA-assay var att man använde prober mot sekvenser i HCV-genomet som var mer högkonserverade mellan genotyper. Dessa bevarade regioner var 5′ otranslaterade sekvenser och sekvenser i HCV-genomets kärngen. Resultatet av ändringarna av mål- och fångstproberna var en dramatisk minskning av variationen i detektionsgraden mellan HCV-genotyperna i den andra generationens test. Var och en av de sex HCV-genotyperna hade en hög detektionsgrad, och det fanns en markant förbättring av detektionen av HCV-genotyperna 2 och 3 (detektion av 93 % respektive 67 % av de prover som man visste innehöll HCV-genotyperna 2 eller 3 i HCV 2.0- och HCV 1.0-analyserna). Känsligheten för andra generationens bDNA-analys var också något högre jämfört med HCV 1.0-analysen (de nedre gränserna för kvantifiering var 2,0 × 105 jämfört med 3,5 × 105 ).

Tredje generationens bDNA-analyser för hiv-1 och HCV

I första och andra generationens bDNA-analyser begränsar oligonukleotidprobernas ospecifika hybridisering med sekvenser som inte är måltavlor känsligheten för analysen. Den avgörande tekniska förbättringen i den tredje generationens bDNA-test (Quantiplex HIV-1 RNA 3.0 assay, Bayer) var att använda icke-naturliga baser, 5′-metyl-2′-deoxyisoguanosin (isoG) och 5′-metyl-2′-isodeoxycytidin (isoC), i syntesen av alla prober i bDNA-systemet, med undantag för de fångarförlängare som förmedlar infångning av den virala målnukleinsyran till plattans yta. Eftersom oligonukleotider som innehåller isoG och isoC inte förekommer i naturen reduceras ospecifik hybridisering avsevärt. Prober som modifierats med de icke-naturliga baserna bildar således inte stabila hybrider med fångstsonden i avsaknad av mål-RNA. I den första beskrivningen av tredje generationens test var detektionsgränsen för hiv-1 i plasmaprover från 11 patienter 50 kopior per mL, vilket innebär en 10-faldig förbättring av detektionsgränsen jämfört med andra generationens test. Under behandling med högaktiv antiretroviral terapi minskade HIV-1-viralbelastningen till under detektionsgränsen för alla 11 patienter.

VERSANT HIV-1 RNA 3.0-analysen har ett dynamiskt intervall på 75 till 5 × 105 HIV RNA-kopior/mL. Version 3.0 har också godkänts för en lägre detektionsgräns som är lika med 50 kopior/mL i flera andra länder. När matchade prover jämfördes i andra generationens hiv-1 bDNA-test (Quantiplex version 2.0) och Amplicor Monitor 1.0 RT-PCR-testet erhölls genomgående lägre antal hiv-1-kopior med bDNA-testet. En nära kvantitativ korrelation i antalet kopior av hiv-1-RNA observerades dock mellan tredje generationens test (version 3.0) och Amplicor Monitor 1.5 RT-PCR-testet.18 Resultaten för virusbelastning i bDNA-testet i version 3.0 och i Amplicor RT-PCR-testet var ungefär två gånger högre än i testet i version 2.0. Kvantitativt likartade resultat i version 3.0 bDNA-testet och RT-PCR-testet är viktiga i patientvården på grund av den sannolika möjligheten att olika metoder kommer att användas vid testning av prover från samma patient för behandling av anti-HIV-behandlingar. Nya uppgifter tyder på att det kanske inte är nödvändigt med en ny baselining för patienter som testas med ett RT-PCR-test.

I likhet med bDNA-testet för hiv-1 version 3.0 använde den tredje generationens bDNA-test för HCV också isoC- och isoG-substituerade oligonukleotider för att minska ospecifik hybridisering. Användningen av isoC- och isoG-substituerade oligonukleotider ökade testkänsligheten ungefär 62 gånger. HCV RNA 3.0-analysens nedre detektionsgräns var 3,2 × 103 kopior/mL jämfört med 2 × 105 kopior/mL i HCV RNA 2.0-analysen. Det dynamiska linjära kvantifieringsområdet för HCV RNA 3.0-analysen sträckte sig från 3,2 × 103 kopior/mL (615 IU/mL) till 4 × 107 HCV RNA-kopior/mL (7,7 × 106 IU/mL). HCV RNA 3.0-testet hade en hög specificitet (98,2 %) och var, i likhet med andra generationens test, lika effektivt vid kvantifiering av HCV RNA för alla genotyper. Standardavvikelserna mellan och inom körningar för replikatprover var 0,2 log10 respektive 0,14 log10, vilket tyder på att tredje generationens analys var mycket reproducerbar.

Förutom utrotning av HCV i serum är ett viktigt mål för anti-HCV-behandlingar att minska HCV-nivåerna i levern. Användbarheten av HCV RNA 3.0-analysen för detektion och kvantifiering av HCV RNA i leverbiopsiprover undersöktes hos 25 patienter som var saminfekterade med HCV och hiv.20 Reproducerbarheten hos tredje generationens HCV bDNA-analys var likartad mellan leverbiopsiprover och serumprover. Dessutom var detektion av HCV RNA i leverprover från patienter infekterade med genotyperna 1, 3 och 4 med HCV RNA 3.0-analysen mycket specifik och känslig. I denna studie av 25 patienter korrelerade höga förbehandlingsnivåer av intrahepatisk

HCV med en låg frekvens av svar på behandling mot HCV. De intrahepatiska HCV-nivåerna före behandling var högst hos patienter som var infekterade med HCV-genotyp 1. Resultaten av denna studie visade att viktiga markörer för HCV-sjukdomsutveckling, HCV-nivåer i lever och serum, kan kvantifieras på ett tillförlitligt sätt genom bDNA-analys under behandling. Metoderna för tredje generationens bDNA-analyser omfattar provberedning, hybridisering och signaldetektion förHIV-1 RNA och HCV RNA. Alla 3 s eps utförs i mikrocellerna på System 340-plattformen för HCV RNA 3.0-analysen som inte kräver något separat extraktionssteg. I testet för version 3.0 av HIV-1 RNA skiljer sig provberedningen från HCV RNA-metoden och utförs utanför System 340-plattformen. I en nyligen genomförd studie utvärderades en anpassning av version 3.0 av hiv-1 RNA-metoden där steget för hiv-1-provberedning ändrades för att möjliggöra samtidig testning för HCV och hiv-1 på System 340-plattformen. Hiv-1-metoden modifierades genom att man utelämnade den två timmar långa inkuberingen vid 63 °C för viral lysis. I stället utfördes hiv-1- och HCV-lysering på System 340-plattformen. HCV bDNA-testmetoderna var oförändrade i den kombinerade analysen. Specificiteten och kvantifieringen med den kombinerade bDNA-metoden låg inom specifikationerna för de enskilda hiv-1- och HCV-testerna. Simultan testning för hiv-1 och HCV förbättrade arbetsflödet i det kliniska laboratoriet och resulterade i lägre kostnader. Eftersom detektion och kvantifiering av hiv-1 RNA och HCV RNA är avgörande för diagnostik och för utvärdering av svar på terapi, utgör möjligheten att utföra samtidiga tester för båda virusen ett betydande framsteg inom molekylär diagnostik.