Upptäckt, aktivitet och karakterisering av ett AA10 lytiskt polysackaridoxygenas från symbionten Teredinibacter turnerae

Expression och enzymatisk karakterisering av AA10 LPMO från T. turnerae

Gamma-proteobakterien T. turnerae är den enda endosymbiont som finns i gälarna hos skeppsborstmaskar som framgångsrikt isolerats, odlats och fått sitt genom kartlagt. Genom automatiserad annotering och manuell BLAST-sökning av T. turnerae-proteomet identifierade vi en gen (NCBI Reference Sequence: WP_019602454.1) som kodar för en AA10 LPMO (nedan kallad TtAA10A). Den förutspådda proteinsekvensen har en N-terminal signalpeptid, LPMO-domänen och en serinrik länkregion som följs av en kolhydratbindande modul (CBM) 10-domän (fig. 1a). AA10 har hittats med CBM2-, CBM3-, CBM5-, CBM10-, CBM12-, CBM18- och CBM73-domäner (Bernard Henrissat, personlig kommunikation) och är kända för att vara aktiva på cellulosa eller kitin. CBM10-domänerna tros vara cellulosabindande och kan därför ge ett erkännande av cellulosa som sannolikt inte är förknippat med en katalytisk händelse. Även om den skiljer sig från de CBM:er som vanligen finns knutna till AA10-proteiner ger dess närvaro i TtAA10A-genens domänstruktur en indikation på att detta protein främst kan vara aktivt på glukosbaserade polysackarider.

Efter flera försök att uttrycka genen med olika affinitets- och löslighets-taggar och olika sekretionssignaler erhölls slutligen tillräckligt med protein för analys genom framställning av en C-terminalt strep-taggad LPMO-katalytisk domän (från His25 till Gly228) i E. coli (fig. 1b). Det renade taggade proteinet laddades med överskott av koppar, avsaltades genom storleksexklusionskromatografi, analyserades för renhet genom SDS-PAGE (Fig. 1c) och masspektrometribaserad proteinidentifiering (ej visad) och användes för efterföljande experiment.

Rekombinant TtAA10A (endast katalytiska domäner, 25-228) uppvisar kännetecknen för en korrekt veckad AA10. Termisk skiftanalys (Thermofluor) av renad, Cu-belastad TtAA10A visar en smälttemperatur (Tm) på 50,4 °C. Om koppar avlägsnas med 10 mM EDTA sänks Tm till 42,5 °C, vilket tyder på en proteinstabiliserande effekt av metallkofaktorn, vilket rapporterats i tidigare litteratur för andra LPMO:er (t.ex. fig. 1d). Vi noterade också en variation i proteinpreparaten, där vissa preparat innehöll en enda Cu-atom (aktivt centrum), medan andra innehöll två Cu-atomer, vilket beskrivs nedan.

Aktivitetsanalyser, på både prover med enkelt och dubbelt Cu-centrum, utfördes på en rad kommersiella polysackaridsubstrat (Avicel, β-chitin från bläckfiskpenna, α-chitin från räkskal, cellohexaos, majsstärkelse, pachyman, xylan från bokskog, glukomannan, xyloglukan, lichenan, galaktan, galaktomannan och mannan) i närvaro av den reducerande kofaktorn gallussyra. Proverna analyserades efter 24 timmar med MALDI-TOF MS och reaktionsprodukternas toppmassor jämfördes med tidigare publicerade data, vilket avslöjade ett blandat C1-C4-oxidationsmönster, uteslutande på cellulosa och beroende av närvaron av elektrondonatorn (fig. 2a, b). Produkterna upptäcktes inte i någon av de negativa kontrollerna (Additional file 1: Figur S1). MALDI-TOF MS-analys av råextrakt från aktivitetsanalyser som utförts med Cu-belastad TtAA10A i närvaro av 10 mM EDTA upptäckte inte frisättning av produkter (data visas inte), vilket tyder på att koppar, som förväntat, är avgörande för aktiviteten.

Synergiexperiment utfördes genom saminkubation av TtAA10A och kommersiella glykosidhydrolaser (GH6 och GH9) i närvaro av Avicel och gallussyra, och de resulterande mono- och oligosackariderna kvantifierades med hjälp av högpresterande anjonbyteskromatografi (HPAEC). Medan reaktioner som innehåller antingen LPMO eller GH ensamma frigjorde försumbara mängder fria sockerarter, visade saminkubationsreaktioner en stark synergistisk effekt, som ytterligare förstärktes av närvaron av elektrondonatorn (fig. 2c, d, Additional file 2: Figur S2). Det är värt att notera att båda de kommersiella GH:erna (GH6 och GH9) som testades under dessa experiment tillhör familjer som identifierades som bland de mest rikliga i skeppsmaskarnas matsmältningsproteom , vilket förstärker den biologiska relevansen av de ovannämnda aktivitetsanalyserna i samband med vedsmältning i skeppsmaskmiljön.

Elektronparamagnetisk resonansspektroskopi

Vårat första bevis för att vissa proteinpreparat innehöll två Cu-platser kom från EPR-analyser. Den frysta lösningens (165 K) X-band CW-EPR-spektrum av Cu-mättad TtAA10A (fig. 3) uppvisade två uppsättningar hyperfintoppar i spektrumets parallella region, vilket indikerar förekomsten av två distinkta kopparkoordineringsgeometrier, som antingen härrör från olika koordineringsmiljöer inom en enskild plats (t.ex. skillnader i ligandernas protoneringstillstånd) eller från en distinkta andra kopparbindande plats. En noggrann simulering av det parallella området i spektrumet kunde erhållas med två olika arter, som var och en gav en annan uppsättning spinhamiltoniska parametrar, gz = 2,267 och |Az| = 425 MHz (art 1) och gz = 2,314 och |Az| = 465 MHz (art 2), tabell 1, med ett förhållande mellan art 1 och 2 på ungefär 3:2. Art 2:s gz-värde är högt jämfört med vad man kan förvänta sig för den typiska AA10 LPMO kopparkoordinationen i den aktiva platsen (spektroskopi av LPMO:s nyligen granskad i Ref. ), på grundval av vilket vi tilldelar art 1 till en koppar som är bunden till den kanoniska histidinspännarens aktiva plats. Dess spinhamiltonvärden är typiska för en axial Cu-koordinationsgeometri som innehåller en blandning av N- och O-donerande ligander . (Observera att art 2 inte kan komma från en fri kopparart i lösning eftersom alla småmolekylära arter avlägsnas under proteinpreparationen; därför härrör alla kopparsignaler i EPR från proteinbunden koppar.)

För att avgöra om de två signalerna härrörde från en enda kopparbindande plats med olika samordningsgeometrier eller från två olika kopparplatser utfördes ett X-band CW-EPR-titreringsexperiment. Proteinet förbehandlades med EDTA (10× proteinkoncentrationen) för att avlägsna eventuell koppar och sedan buffertbyttes för att avlägsna eventuell EDTA. Detta kopparfria proteinprov testades och visade som väntat ingen kopparbaserad signal. Tillsats av 0,2 ekvivalenter koppar (jämfört med proteinkoncentrationen) visade en enda signal i det parallella området, som tilldelades koppar(II)-jonen inom histidinspännans aktiva plats (art 1). Ytterligare tillsatser av koppar ökade denna kopparsignal för histidinspännen, med samtidig ökning av signalen för art 2, som redan var tydlig efter 0,4 ekvivalenter koppar (Additional file 3: Figur S3). Dessa titreringsexperiment utfördes vid ett fast pH och visar att de två species i EPR-spektrumet hos kopparmättad TtAA10A representerar två olika Cu-bindningsställen med något olika kopparbindningsaffinitet, där species 1 är det ställe med högre affinitet. Dessutom lämnades provet av TtAA10A med 0,4 ekvivalenter Cu vid 4 °C i 48 timmar och dess EPR-spektrum undersöktes på nytt. Detta prov visade ingen skillnad i förhållandet mellan koppararter, vilket visar att de olika bindningsställena inte uppstod på grund av stora skillnader i kopparbindningens kinetik.

Näringsmässigt isolerades i flera av de preparat som vi framställde ett prov av TtAA10A som uppvisade endast en enda kopparsignal i EPR-spektrumet. Orsakerna till denna skillnad i kopparstoikometri hos det isolerade proteinet är oklara eftersom dessa prover uppenbarligen framställdes under identiska förhållanden som de som gav TtAA10A med två distinkta Cu-signaler i X-band EPR-spektrumet (species 1 och species 2). Vi kunde inte påvisa några skillnader i aktivitet för dessa preparat med enkel kopparockupation i förhållande till tidigare prover, men vi kunde dra nytta av dessa prover för att mäta både X-band- och Q-band CW-EPR-spektra för TtAA10A:s Cu i det aktiva centret (Fig. 4) med endast histidinspetsen ockuperad, vilket bedömdes genom hänvisning till tidigare spektra. Detta prov gjorde det därför möjligt för oss att utföra en samtidig anpassning av både X-bands- och Q-bandsspektren för att få fram mer exakta spinhamiltoniska parametrar för kopparjonen i den aktiva platsen i histidinspännet (art 1). Dessa värden redovisas i tabell 2. Tillsats av PASC till TtAA10A orsakade ingen förändring av EPR-spektren (data visas inte).

3D-struktur för TtAA10A

För att få ytterligare insikter i den molekylära grunden för de biokemiska egenskaperna hos TtAA10A och för att undersöka denna, potentiellt ovanliga, dubbla Cu-struktur bestämde vi kristallstrukturen för det rekombinant uttryckta proteinet med en upplösning på 1,4 Å (Additional file 4: Table S1). Den övergripande strukturen avslöjade ett centralt immunoglobulinliknande veck dekorerat med slingor och ett spiralformigt buntband som vanligtvis observeras för enzymer från denna familj (fig. 5). Strukturella jämförelser med hjälp av DALI-servern avslöjar de närmaste strukturella överensstämmelserna med Cellvibrio japonicus AA10A (PDB ID 5fjq) och Serratia marcescens CBP21 (PDB ID 2bem) med RMSD:er på 2,4 Å och 2,3 Å över 180 respektive 170 Cα-positioner, vilket innebär endast 30 % identitet på sekvensnivå. Med tanke på den höga aktiviteten hos TtAA10A på cellulosa kan det vara något förvånande att de två närmaste strukturella motsvarigheterna till detta enzym är chitinaktiva AA10. Den tredje närmaste strukturella överensstämmelsen var dock AA10 från Streptomyces coelicolor (ScAA10, PDB ID 4oy7 ) som är en cellulosaspecifik AA10 som ger en RMSD på 2,5 Å över 160 Cα-atomer. TtAA10A och ScAA10 har endast 26 % sekvensidentitet trots att de är aktiva på samma substrat, vilket ytterligare belyser svårigheten med att relatera LPMO:s substratspecificitet enbart utifrån sekvens och övergripande struktur (diskuteras ytterligare i samband med AA9 i Ref. ).

Som för alla LPMO:er som studerats hittills (enligt definitionen av deras aktivitet) bildas TtAA10A:s aktiva plats av motivet ”histidinspänne”, som är placerat i mitten av en nästan plan yta (fig. 5a, b). En enda kopparjon modellerades i denna position, koordinerad i en typisk T-formad geometri av aminoterminus och sidokedja av His 1 och sidokedjan imidazol av His 107. I de axiella positionerna runt kopparjonen på den aktiva platsen har TtAA10A Phe 195 och Gly 105. Dessa positioner upptas ofta av en fenylalanin/tyrosin respektive en alanin-sidokedja i andra AA10. Den sistnämnda har varit inblandad i skapandet av en sterisk miljö som driver bildandet av den förvrängda koordinationsgeometrin på den aktiva platsen som observeras i chitinspecifika AA10 i deras Cu(II)-oxidationstillstånd . Här gör utbytet av Ala mot Gly att kopparen på den aktiva platsen kan anta en något mer axiell koordinationsgeometri, som ligger närmare den som är typisk för AA9 och cellulosaaktiva AA10 och som stämmer överens med spinnhamiltonparametrarna för art 1 i vår tidigare beskrivna EPR-analys, fig. 4. LPMO-kristallstrukturer är ofta förföljda av fotoreduktion till följd av strålningsskador så att den aktiva platsens vilande geometri inte kan observeras direkt i kristallstrukturer (exempel inkluderar ). Analysen av den sfär som omger kopparjonen i TtAA10A avslöjar endast en svag densitet för en vattenmolekyl 2,6 Å från kopparen och en starkare densitet för en andra vattenmolekyl 3,2 Å bort med vätebindning till Glu 53. Dessa vattenmolekyler är för långt från kopparen för att anses vara direkt koordinerande. Det verkar därför som om kopparen i detta enzym också har genomgått fotoreduktion till Cu(I)-oxidationstillståndet.

Vår struktur avslöjar positionen för den andra kopparbindningsplatsen som observerades i EPR-spektren. Denna plats ligger 14,4 Å (Cu…Cu) från histidinspännens kopparjon i en stor negativt laddad fläck på proteinytan (fig. 5a, b; Additional file 5: Figure S4). Denna andra kopparjon är direkt koordinerad av His 165, Glu 5, Asp 101, en vattenmolekyl och His 207* som tillhandahålls av Strep-taggen från en intilliggande molekyl i kristallen. På grund av observationen av denna interaktion kontrollerade vi proteinets oligomeriska tillstånd i lösning med hjälp av SEC-MALLS (Additional file 6: Figur S5). Detta bekräftade att proteinet är monomeriskt, vilket tyder på att koppar-His207*-interaktionen är en kristallartefakt (även om den kan antyda en potentiell protein-proteininteraktion). Trots detta, tillsammans med EPR-data, tyder strukturen på att denna andra plats är upptagen i lösning, där His 207* troligen är ersatt av en vattenmolekyl. Flera sekvensanpassningar av de 500 bästa TtAA10A-ortologerna som identifierats genom BlastP-sökningar visar att medan en sur rest i position 5 inte är ovanlig bland AA10, är resterna 101 och 165 i stort sett bevarade endast inom LPMOs från bakterier som är nära besläktade med Teredinibacter.

Det har förts en omfattande debatt om möjliga positioner där elektrondonatorer, både små molekyler och proteiner, kan binda till LPMOs för att möjliggöra katalys när enzymet är bundet till den fasta substratytan (se till exempel ). En undersökning av TtAA10A-strukturen med avseende på potentiella laddningsöverföringsvägar med hjälp av programmet EHPath visar att det finns en tydlig och snabb hålhoppningsväg med en genomsnittlig hålförvaringstid på endast 20 ms mellan histidin 1 och tyrosin 3 (10 Å avstånd). Tyrosin 3 ligger i anslutning (5,3 Å) till den andra kopparplatsen, vilket ger en effektiv laddningsöverföringsväg mellan de två kopparplatserna. Med tanke på den potentiella laddningsöverföringsvägen mellan de två kopparplatserna undersökte vi därför om den andra metallplatsen (i vårt fall ockuperad av koppar, även om vi inte kunde förflytta Cu med Fe-, Ni-, Zn- och Mn-salter) utgör en bindningsplats för en redoxpartner i form av ett protein (bindningen av ett annat protein till denna plats antyds av Strep-taggets förening med en angränsande molekyl i kristallgitteret), och vi försökte dra ner proteiner från T. turnerae som kan interagera stabilt med TtAA10A med hjälp av en affinitetskolonn (StrepTrap HP) med immobiliserat TtAA10A. Dessa experiment (data visas inte) ledde inte till isolering av några kandidatproteinbaserade aktivatorer för TtAA10A, men det kan inte uteslutas att ett aktiverande enzym skulle kunna binda övergående i denna region för att möjliggöra elektronöverföring till LPMO och därmed initiering av katalysen. Det bör dock noteras att vi under strukturförfiningen också identifierade en natriumbindningsplats på proteinytan (Additional file 7: Figur S6). Huruvida dessa ytterligare bindningsställen är ett resultat av den ökade laddning som detta protein kan behöva för att vara stabilt i den salthaltiga miljö som T. turnerae befinner sig i förblir en öppen fråga. Icke desto mindre kan dessa ytegenskaper hos TtAA10A vara av intresse för enzymingenjörer om LPMOs ska stabiliseras eller anpassas till specifika förhållanden för att kunna användas i industriella bioreaktorer.