Validering av antikroppar
Antikroppsvalidering
Inte alla antikroppar är giltiga för varje experiment och tillstånd, De måste valideras för den specifika tillämpningen och arten. För närvarande finns det ingen standardmetod för ”antikroppsvalidering”, och detta kan i hög grad påverka experimentell reproducerbarhet och tillförlitlighet. Tidskrifter och bidragsgivande organ har vidtagit åtgärder för att åtgärda denna brist. Många har nu krav på att uttryckligen ange hur man kommer att validera en antikropp för en specifik användning. Tyvärr finns det inga allmänt accepterade kriterier för validering av antikroppar. Så det är upp till varje forskare att validera varje enskild antikropp för den avsedda tillämpningen.
Grundläggande validering
Standardmetoderna för validering av antikroppar omfattar western blot, ELISA, flödescytometri och IHC. De flesta forskare är bekväma med dessa beprövade metoder. Valideringsprocessen kan vara tidskrävande eftersom forskaren eller tillverkaren måste validera antikroppen för varje tillämpning. Denna svårighet förvärras av att förhållandena för varje test är olika. Ett Western blot är till exempel beroende av att proteinerna denatureras. En antikropp som validerats för Western Blot kan alltså fungera bra under denaturerande förhållanden, men kan misslyckas med att känna igen antigener i deras naturliga konformation (dvs. ELISA).1 På samma sätt kan en antikropp som validerats för naturlig proteinaffinitet misslyckas med att binda samma antigen efter denaturering eller fixering.
Ovanstående metoder spelar en nödvändig roll i valideringen av antikroppar. Vi kan dock inte förlita oss enbart på dessa metoder, eftersom de inte representerar de ständigt växande tillämpningarna. Tillförlitlighetsnivån för de validerade antikropparna kan ökas genom att inkludera andra valideringstekniker.
Gamla tekniker, nya användningsområden
För att komma till rätta med bristerna i den grundläggande valideringen av antikroppar samlades nyligen en grupp forskare för att ”föreslå en uppsättning standardriktlinjer för validering av antikroppar”.2 De föreslår att forskarna, utöver de grundläggande metoderna för validering av antikroppar, börjar luta sig mot begreppsliga grundpelare. Dessa omfattar genetiska strategier, oberoende antikroppsstrategier och uttryck av märkta proteiner.2
-
Genetiska strategier: CRISPR-Cas9 med mera
Genetiska strategier består av tekniker somCRISPR-Cas9, RNAi och siRNA-knockdown, som används tillsammans med en test för proteindetektion. Dessa metoder upptäcker eventuell ospecifik bindning av antikroppen i fråga efter att ha slagit ut eller sänkt den lämpliga genen. Om antikroppen är specifik bör ingen eller en minskad signal från antikroppen upptäckas i de utslagna eller nedlagda cellinjerna.
-
Independent Antibody Approach
Användning av oberoende antikroppar är en annan metod som skulle kunna detektera ospecifik bindning. Den oberoende antikroppsmetoden använder två olika (oberoende) antikroppar som binder samma antigen men olika epitoper. Därför bör de två antikropparna uppvisa samma detektionsmönster och ingen off-target-bindning.2 Denna teknik kräver flera prover för testning för att kontrollera varierande målproteinuttryck, vilket kan bli dyrt och tidskrävande.2 Dessutom är valideringstekniken beroende av att det finns flera antikroppar som känner igen olika epitoper på samma målprotein. GenScript erbjuder epitope binning iMonoExpress™ mAb-tjänster som inkluderar ”oberoende antikroppar” för proteinantigen.
-
Märkt proteinuttryck
Analysering av detektering av märkta målproteiner kan också ge ett sätt att mäta den ospecifika bindningen av antikroppar. I denna metod modifieras målproteiner med antingen en affinitetsmärkning (t.ex. FLAG) eller ett fluorescerande protein (t.ex. GFP). I likhet med metoden med oberoende antikroppar jämförs sedan detektionsmönstret för den antikropp som ska valideras med det för den taggspecifika antikroppen. Även om det är okomplicerat är ett problem med denna metod att se till att de taggade proteinerna uttrycks på endogena nivåer, eftersom ”överexpression kan maskera upptäckten av bindningshändelser utanför målet”.2
Rekombinanta antikroppar som ett alternativ till monoklonala antikroppar?
I en nyligen utfärdad uppmaning om att vidta åtgärder när det gäller valideringen av antikroppar föreslogs det att forskarna endast skulle använda rekombinanta antikroppar, i stället för polyklonala eller till och med monoklonala antikroppar. Monoklonala antikroppar framställs med hjälp av hybridomcellinjer. Tyvärr kan hybridomcellinjer dö, förlora sina antikroppskodande gener eller inte växa när de tas upp ur frysförvaring.3 Dessutom kan hybridomproducerade monoklonala antikroppar binda till mer än en måltavla. Genom att bestämma sekvensen för den antikropp som kodas av hybridomet och genom att producera antikroppen rekombinant kan dessa problem övervinnas. På grund av den definierade sekvensen kan rekombinanta antikroppar dessutom ge ytterligare ett lager av validering jämfört med om man enbart använder ovanstående tekniker.3
Dessa ytterligare valideringsmetoder syftar till att ”bevisa att en antikropp binder sitt mål, och i de flesta fall bör de också göra det möjligt att utvärdera potentiell korsreaktivitet under de testade förhållandena”.2 Gamla och nya strategier måste dock troligen kombineras för att en antikropp skall kunna valideras på ett korrekt sätt.
Välja lämplig metod för validering av antikroppar
Med alla dessa frågor kring antikroppar, hur väljer man då lämplig metod?
För det första måste man bestämma sig för i vilken analys man ska använda antikroppen. CRISPR-Cas9-metoden innebär till exempel ingen modifiering av målproteinet och validerar att antikroppen saknar korsreaktivitet med andra proteiner. Du kan alltså använda den här tekniken för att validera antikroppar för en mängd olika analyser, inklusive western blot, IHC, immunocytokemi (ICC), flödescytometri, ELISA, immunutfällning (IP), kromatinimmunutfällning (ChIP) och proteinanalyser i omvänd fas.2 På grund av svårigheterna med att uttrycka ett modifierat protein föreslås dock validering av en antikropp med hjälp av uttryck av märkta proteiner endast för western blots, IHC, ICC och flödescytometri.
För det andra måste forskaren vara medveten om provbegränsningarna för sådana valideringsmetoder. Som exempel kan både CRISPR-Cas9/KO- och taggade proteinexpressionstekniker inte användas för att validera antikroppar i mänskliga vävnadsprover och kroppsvätskor, t.ex. plasma och serum2. Det beror på att man inte kan utföra genetisk manipulation i människor, till skillnad från i cellinjer.
Slutligt måste forskaren, oavsett vilken antikropp och respektive valideringsmetod som används av antikroppsleverantören, utföra minst en valideringsstrategi i sin specifika tillämpning eller provkontext.2
Validering av varje antikropp för din specifika tillämpning och art är nyckeln till att uppnå reproducerbara och tillförlitliga resultat. Informationen kommer att hjälpa dig att vägleda ditt beslut om vilka metoder som är lämpliga att använda i ditt laboratorium. För ytterligare hjälp med validering av antikroppar eller andra tillämpningar, besök GenScript Antibody Technical Resources.
Adapterat från innehåll skapat av BitesizeBio på uppdrag av GenScript.