Technologie rozvětvené DNA (bDNA)

Úvod

Test rozvětvené DNA (bDNA) představuje jedinečný a výkonný nástroj pro spolehlivou kvantifikaci molekul nukleových kyselin. Test bDNA se zásadně liší od metod amplifikace cílových sekvencí, jako je PCR, a měří přímo molekuly nukleových kyselin na fyziologických hladinách zesílením reportérového signálu, nikoli replikací cílových sekvencí jako prostředku detekce, a proto se vyhýbá chybám spojeným s extrakcí a amplifikací cílových sekvencí. Test bDNA využívá lineární zesílení signálu pomocí syntetických oligonukleotidových sond a molekul bDNA a může přesně a precizně měřit přibližně 500 až 10 000 000 molekul. Nové pokroky v technologii bDNA zahrnují přidání předzesilovacích molekul a začlenění nových nukleotidů isoC a isoG do sekvencí oligonukleotidových sond pro další zvýšení signálu a snížení šumu způsobeného nespecifickou hybridizací složek testu bDNA. Tato vylepšení rozšířila kvantitativní detekční limit testu bDNA až na 50 molekul.

Historie technologie bDNA

Test bDNA, který se dobře hodí pro rutinní použití v klinickém nebo výzkumném prostředí, byl úspěšně použit v řadě oblastí, včetně prognózy a sledování pacientů s virovými onemocněními. Testy bDNA, které poskytují spolehlivý prostředek pro přímou kvantifikaci virové nálože v klinických vzorcích, byly vyvinuty pro měření DNA viru hepatitidy B, RNA viru hepatitidy C, RNA viru lidské imunodeficience typu 1 a DNA cytomegaloviru. Díky vlastnímu návrhu oligonukleotidových sond sahají potenciální aplikace testu bDNA daleko za rámec kvantifikace virových nukleových kyselin. Vytvořením oligonukleotidových sond pro specifické sekvence cílových molekul nukleových kyselin byl test bDNA přizpůsoben široké škále aplikací. Výzkumníci například navrhli sondy pro test bDNA k měření hladin buněčné mRNA. To se ukázalo jako plodný přístup pro řadu výzkumných aplikací, včetně sledování změn hladin mRNA cytokinů u zdravé a imunokompromitované populace pacientů, zkoumání vzorců sestřihu inzulínu a hodnocení indukce stresových genů pro aplikace v molekulární toxikologii. Vzhledem ke své univerzálnosti, snadnému použití a vysoké úrovni výkonnosti se test bDNA rychle stává metodou volby pro kvantifikaci nukleových kyselin

Outline

Test bDNA používá 96jamkový formát mikrotitračních destiček a je založen na sérii specifických hybridizačních reakcí a chemiluminiscenční detekci hybridizovaných sond. Na povrchu každé mikrodestičky jsou připevněny „záchytné“ sondy, které obsahují specifickou sekvenci nukleotidů. Tyto záchytné sondy se vážou na podskupinu „cílových sond“, které jsou vázány na specifické nukleotidové sekvence v cílové molekule nukleové kyseliny. Tato série hybridizací ukotví cílovou molekulu nukleové kyseliny na povrchu mikrobuněk. Detekce cílové nukleové kyseliny a zesílení signálu se provádí prostřednictvím další série hybridizací.

Druhá podskupina cílových sond spojuje molekulu cílové nukleové kyseliny s molekulami zesilovače bDNA. Přidáním předzesilovacích molekul, které poskytují další vrstvu zesílení mezi cílovými sondami a molekulami zesilovače bDNA, lze dosáhnout ještě většího zesílení signálu. Každá molekula zesilovače bDNA byla navržena tak, aby obsahovala 15 ramen, z nichž každé obsahuje tři vazebná místa pro „značkovací sondy“ konjugované s alkalickou fosfatázou. Chemiluminiscenční signál se generuje po zavedení dioxetanového substrátu, který je aktivován alkalickou fosfatázou. Tento signál lze snadno kvantifikovat počítáním počtu emitovaných fotonů v luminometru. Test bDNA je ze své podstaty kvantitativní, protože počet emitovaných fotonů přímo souvisí s množstvím cílové nukleové kyseliny ve vzorku.

Materiály

Vybavení – ohřívač destiček Chiron vybavený držákem mikrodestiček 8×12 – luminometr Chiron pro čtení z destiček

Reagencie pro den 1

• Oligonukleotid-.modifikované mikrodestičky
• Lyzační ředidlo
• Lyzační činidlo (proteináza K)
• Cílové sondy pro záchyt
• Cílové sondy pro značení
• Specifikované vzorky
• Standardy a kontroly (nepovinné)

Reagencie pro den 2

Postup

Den 1

1. Příprava pracovního činidla pro vzorky kombinací:

• 6 mllyzačního ředidla
• 600 ml lyzačního činidla
• 32 ml 500 fm/ml cílových sond pro zachycení (20 fm/200 ml finální)
• 96 ml500 fm/ml cílových sond pro označení (60 fm/200 ml finální)

Poznámka: Skutečné koncentrace cílových sond se liší v závislosti na cílové molekule nukleové kyseliny.

1. Pro vzorky plazmy nebo séra napipetujte 150 ml Specimen Working Reagent a 50 ml séra nebo plazmy do duplicitních oligonukleotidy modifikovaných mikrojader. Pro vzorky buněk nebo tkání připravte a extrahujte pelety RNA ve Specimen Working Reagent, jak je popsáno, a pipetujte 200 ml každého extraktu RNA do duplikátních oligonukleotidem modifikovaných mikrodírek.
2. Pokud je to žádoucí, lze pro účely specifičnosti zahrnout pozitivní a negativní kontroly. Kontroly by měly být zpracovány stejným způsobem, jak je popsáno pro vzorky v kroku 2 (výše), a měly by být provedeny ve dvou opakováních.
3. Pokud je to žádoucí, lze zařadit standardy pro absolutní kvantifikaci. Pipetujte 150 ml pracovního činidla pro vzorky a 50 ml příslušného členu standardní křivky do duplicitních oligonukleotidy modifikovaných mikrodestiček.
4. Mikrodestičky uzavřete mylarovou fólií a inkubujte je přes noc při 53 °C v ohřívači destiček Chiron. (Poznámka: Teplota bude záviset na definované optimální teplotě pro konkrétní test.)

Den 2

1. Vyjměte desku z ohřívače desek Chiron a nechte ji 10 minut stát při pokojové teplotě. Zatímco destička chladne, připravte roztok zesilovače naředěním koncentrátu zesilovače v koncentraci 200 fm/ml ve značkovacím ředidle. Konečná koncentrace by měla být 10 fm/50 ml.
2. Mikrojamky dvakrát promyjte promývacím roztokem A a poté do každé jamky napipetujte 50 ml naředěného zesilovače. Inkubujte mikrojímky 30 min při 53 °C v ohřívači destiček Chiron.
3. Vyjměte destičku z ohřívače destiček Chiron a nechte ji 10 min stát při pokojové teplotě. Zatímco destička chladne, připravte pracovní roztok pro označení naředěním sondy pro označení v koncentraci 500 fm/ml do roztoku pro označení. Konečná koncentrace by měla být 20 fm/50 ml.
4. Mikrojamky dvakrát propláchněte promývacím roztokem A a poté do každé jamky napipetujte 50 ml pracovního roztoku pro označení. Inkubujte mikrodestičky 15 minut při 53 °C v ohřívači destiček Chiron.
5. Vyjměte destičku z ohřívače destiček Chiron a nechte ji 10 minut stát při pokojové teplotě. Během této doby připravte substrátový roztok z 99,7 % v/v LumiphosPlus a 0,3 % v/v 10% SDS (například: 3 ml LumiphosPlus, 9 ml 10% SDS).
6. Mikronádobky dvakrát promyjte promývacím roztokem A a poté třikrát promývacím roztokem B. Do každé jamky přidejte 50 ml substrátového roztoku.
7. Měřte chemiluminiscenci v luminometru pro čtení destiček. (To zahrnuje inkubaci mikrojamek po dobu 30 minut při 37 °C před měřením, aby se dosáhlo ustáleného kinetického stavu).

Řešení problémů

• S jamkami modifikovanými oligonukleotidy je třeba zacházet opatrně. Nerozdělujte proužky jamek na segmenty. Jamky pevně uzavřete čerstvým těsněním destiček, abyste zabránili odpařování během inkubace. Při odstraňování těsnění destiček po inkubaci dávejte pozor, abyste jamky nevytáhli z držáku mikrodestiček.
• Všechny vzorky, standardy a kontroly by měly být pro optimální kvantifikaci testovány ve dvojím provedení. Prázdné lipemické nebo zakalené vzorky mohou vést k neprůkazným výsledkům.
• Pro optimální výsledky by měla být všechna činidla před použitím uvedena na teplotu uvedenou v postupu stanovení. Přidejte činidlo do mikrotitračních jamek tak, že se dotknete špičkou pipety stěny poblíž středu jamky, nad povrchem tekutiny v jamce.

Použití

Kvantifikace virů nebo testování virové zátěže se stalo součástí rutinní léčby pacientů infikovaných virem HIV-1 nebo virem hepatitidy C (HCV). V současné době existuje několik molekulárních technologií, které jsou k dispozici pro použití v klinických laboratořích. Z nich pouze testy rozvětvené DNA (bDNA) jsou schváleny FDA pro testování virové zátěže HIV-1 a HCV. Tato technologie zesílení signálu je postavena na sérii hybridizačních reakcí, které jsou velmi vhodné pro plnou automatizaci, a snižují tak množství práce potřebné k provedení tohoto typu analýzy.

Molekulární diagnostické testy využívající technologii bDNA pro detekci cílových molekul nukleových kyselin jsou citlivé, specifické a spolehlivé nástroje pro diagnostiku virových a bakteriálních infekcí a pro sledování vývoje onemocnění v průběhu léčby. bDNA testy se vyvinuly z vývojových stádií ve výzkumné laboratoři až po kvantitativní testy schválené americkým Úřadem pro kontrolu potravin a léčiv s cenným klinickým využitím. Testy bDNA jsou méně náročné na pracovní sílu než mnohé postupy založené na molekulární analýze, protože je lze velmi dobře automatizovat. Při použití bDNA není nutná amplifikace cílové sekvence, a proto je u testů bDNA méně pravděpodobná křížová kontaminace mezi opakovanými vzorky v důsledku nadměrného množství amplikonů nebo přenosu. Kromě toho, protože bDNA je technologie amplifikace signálu, je test schopen kvantifikovat s méně než 0,5 log nebo 3násobnou variabilitou v celém svém dynamickém rozsahu.

Technologie bDNA se ukázala jako univerzální, protože byly vyvinuty metody pro detekci infekce širokou škálou mikroorganismů, včetně parazita Trypanosoma

brucei, cytomegaloviru, bakterií Staphylococcus citlivých na antibiotika a rezistentních na antibiotika, lidského papilomaviru a viru hepatitidy B. V poslední době se však úsilí zaměřilo na vývoj testů bDNA pro kvantifikaci RNA viru HIV-1 a viru hepatitidy C (HCV), což vedlo k rutinnímu používání metod bDNA v laboratořích klinické molekulární diagnostiky. Při popisu pokroku metod bDNA je v tomto přehledu kladen důraz na testy bDNA pro HIV-1 a HCV.

První generace testů bDNA pro HIV-1

Přesné a reprodukovatelné testy bDNA první generace byly vyvinuty pro detekci HIV-1 RNA a HCV RNA v lidské plazmě (Quantiplex HIV-1 nebo HCV RNA 1.0 assay, Bayer, Tarrytown, NY).9-11 V jedné z prvních zpráv o testu Quantiplex bDNA nebyla při použití vzorků plazmy od séronegativních dárců při použití testu první generace

bDNA pozorována žádná reaktivita, což ukazuje na vynikající specifičnost.9 Pozitivní výsledky testu bDNA byly pozorovány u 83 % vzorků od 348 pacientů, kteří byli séropozitivní na HIV-1.9 Dynamický rozsah kvantifikace pomocí testu Quantiplex HIV-1 RNA 1.0 sahal od 104 (dolní mez detekce) do více než 106 kopií HIV RNA/ml.9,11 Při použití testu bDNA byly statisticky významné změny virové nálože 2 až 3násobné, což naznačuje, že test Quantiplex HIV-1 RNA 1.0 byl vysoce přesný a reprodukovatelný.11 Pro srovnání, při použití prvních verzí testu RT-PCR bylo nutné dosáhnout změn virové nálože nejméně 3,7 až 5,8násobných, aby byly výsledky statisticky významné.11 Proto se bDNA stala metodou volby pro většinu klinických studií hodnotících testování virové nálože a klinickou účinnost nových inhibitorů reverzní transkriptázy a proteázy HIV-1.

Citlivost metody detekce bDNA byla zvýšena v testu HIV-1 druhé generace (Quantiplex HIV-1 RNA 2.0 assay, Bayer) změnou designu cílových a záchytných sond a přidáním preamplifikačních oligonukleotidů. Vylepšená konstrukce cílových a záchytných sond umožnila zvýšit přísnost hybridizace, čímž se snížilo pozadí testu. Předzesilovače výrazně zvyšují intenzitu signálu, protože každá molekula předzesilovače má více oblastí pro hybridizaci s mnoha molekulami bDNA. Kromě toho má každá molekula bDNA více opakujících se sekvencí pro hybridizaci sond značených AP. Výstupní signál při použití testu Quantiplex HIV-1 RNA 2.0 vykazoval linearitu od přibližně 500 kopií/ml do 1,6 × 106 kopií/ml (udávaný dynamický rozsah byl 500 až 8 × 105 kopií/ml). Citlivost testu HIV-1 bDNA druhé generace se ve srovnání s testem první generace zvýšila 20krát (dolní meze detekce byly 500 kopií/ml a 10 × 104 kopií/ml). V rozsáhlé analýze přesnosti byly porovnány výsledky původních testů a výsledky opakovaných testů v testu Quantiplex HIV-1 RNA 2.0 . Bylo zjištěno, že test HIV-1 RNA 2.0 je vysoce reprodukovatelný.14 Ze 174 vzorků s virovou zátěží vyšší než 5 000 kopií/ml byl u 96 % rozdíl v počtu kopií mezi původními výsledky a výsledky opakovaného testu menší než 0,3 log10. Z 69 vzorků s virovou zátěží mezi 500 a 5 000 kopií/ml mělo 86 % rozdíl mezi původními a opakovanými výsledky menší než 0,3 log10. Avšak mezi 5 339 pacienty, kteří byli testováni v rámci rutinního klinického testování během ročního intervalu, byla virová zátěž nižší než 500 kopií/ml pozorována u 41,6 % vzorků.

Pro značnou část pacientů byl proto zapotřebí test bDNA s vyšší citlivostí (tj. nižší mez detekce <500 kopií/ml).

Výkonnostní charakteristiky testu Quantiplex HIV-1 RNA 2.0 a testu RT-PCR (test Amplicor HIV-1 Monitor 1.0, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) byly porovnány s použitím ředění standardních vzorků, u nichž byl znám počet kopií viru HIV-1. Při testování ředění stejných standardů v obou testech byl počet kopií viru HIV-1 obecně vyšší u testu RT-PCR než u testu bDNA. Například rozmezí počtu kopií RNA bylo 900 až 7,68 × 105 kopií/ml v testu bDNA a 3 360 až 1,88 × 106 kopií/ml v testu RT-PCR. Oba testy byly lineární pro uvedené dynamické rozsahy.

Porovnání sklonů regresních přímek počtu kopií HIV-1 vs. výstupní signál naznačuje, že test bDNA měl menší proporcionální systematickou chybu. Variabilita mezi sériemi při použití standardního vzorku s 1 650 kopiemi HIV-1/ml byla u testu bDNA nižší než u testu RT-PCR; variační koeficienty pro testy bDNA a RT-PCR byly 24,3 %, resp. 34,3 %, což naznačuje, že test bDNA byl při tomto počtu kopií HIV-1 RNA o něco přesnější. V porovnání s použitím standardu 1 650 kopií/ml byly variační koeficienty mezi jednotlivými sériemi vyšší pro vzorek obsahující 165 kopií HIV-1 RNA/ml (44,0 % a 42 %).7 % pro testy bDNA a RT-PCR). Výsledky testů byly podobné při porovnávání stejného počtu kopií HIV-1 napříč podtypy HIV A až F pomocí testu bDNA. Pomocí této verze RT-PCR však byly subtypy A, E a F detekovány méně účinně než subtypy B, C a D. Na rozdíl od této verze RT-PCR byly subtypy A, E a F detekovány méně účinně. Rozdíly mezi testem bDNA druhé generace a testem Amplicor Monitor RT-PCR pro kvantifikaci HIV-1 naznačily, že je nutná konzistence testovací metody pro každého jednotlivého pacienta v průběhu diagnostiky a léčby.

Testy bDNA pro HCV

Při pokračování vývoje zdokonaleného testu bDNA pro HIV-1 třetí generace si společnost Bayer uvědomila potřebu vyvinout test virové zátěže HCV s nově vznikající klinickou využitelností podobnou té pro testování HIV-1. Pro detekci HCV měl test bDNA první generace (Quantiplex HCV RNA 1.0 assay, Bayer) dynamický rozsah kvantifikace v lidské plazmě od 3,5 × 105 do 1,2 × 108 kopií HCV RNA/ml. Pomocí tohoto testu byly detekovány genotypy 1 až 6, ačkoli citlivost byla nižší pro genotypy 2 a 3 (67% míra detekce: pozitivní signál u 60 z 89 vzorků séra, o nichž bylo známo, že obsahují genotypy HCV 2 nebo 3) ve srovnání s genotypem 1 (97% míra detekce: pozitivní signál u 67 z 69 vzorků séra, o nichž bylo známo, že obsahují genotyp HCV 1). Srovnání testu Quantiplex HCV RNA 1.0 a testu RT-PCR pro HCV vyvinutého výzkumnou laboratoří ukázalo vyšší citlivost testu RT-PCR, který měl spodní hranici detekce 2,5 × 104 kopií HCV RNA/ml. Test HCV bDNA měl však větší reprodukovatelnost a byl méně časově náročný než laboratorně vyvinutý test HCV RT-PCR.

Pro zlepšení míry detekce genotypů HCV 2 a 3 byl vyvinut test druhé generace (test Quantiplex HCV RNA 2.0, Bayer).15 Hlavní změnou konstrukce testu HCV RNA druhé generace bylo použití sond k sekvencím v genomu HCV, které byly více konzervované napříč genotypy. Těmito konzervovanými oblastmi byly 5′ nepřekládané sekvence a sekvence v jádrovém genu genomu HCV. Výsledkem změn cílových a záchytných sond bylo výrazné snížení rozdílů v míře detekce mezi genotypy HCV v testu druhé generace. Každý ze 6 genotypů HCV měl vysokou míru detekce a došlo k výraznému zlepšení detekce genotypů HCV 2 a 3 (detekce 93 % vs. 67 % vzorků, o kterých bylo známo, že obsahují genotypy HCV 2 nebo 3 v testech HCV 2.0 a HCV 1.0). Také citlivost testu bDNA druhé generace byla mírně zvýšena ve srovnání s testem HCV 1.0 (dolní meze kvantifikace byly 2,0 × 105 oproti 3,5 × 105 ).

Třetí generace testů bDNA pro HIV-1 a HCV

V testech bDNA první a druhé generace omezovala citlivost testu nespecifická hybridizace oligonukleotidových sond na necílové sekvence. Rozhodující technologické zlepšení v testu bDNA třetí generace (Quantiplex HIV-1 RNA 3.0, Bayer) bylo použití nepřirozených bází, 5′-methyl-2′- deoxyisoguanosinu (isoG) a 5′-methyl-2′-isodeoxycytidinu (isoC), při syntéze všech sond v systému bDNA, s výjimkou záchytných extenderů, které zprostředkovávají zachycení cílové virové nukleové kyseliny na povrchu destičky. Protože se oligonukleotidy obsahující isoG a isoC v přírodě nevyskytují, je nespecifická hybridizace výrazně omezena. Sondy modifikované nepřirozenými bázemi tak v nepřítomnosti cílové RNA nevytvářejí stabilní hybridy se záchytnou sondou. V úvodním popisu testu třetí generace byla hranice detekce HIV-1 ve vzorcích plazmy od 11 pacientů 50 kopií na ml, což představuje desetinásobné zlepšení hranice detekce ve srovnání s testem druhé generace. Během léčby vysoce aktivní antiretrovirovou terapií poklesla virová nálož HIV-1 u všech 11 pacientů pod hranici detekce.

Test VERSANT HIV-1 RNA 3.0 má dynamický rozsah 75 až 5 × 105 kopií HIV RNA/ml. Verze 3.0 byla také schválena do dolní meze detekce rovnající se 50 kopií/ml v několika dalších zemích. Při porovnání odpovídajících vzorků v testu HIV-1 bDNA druhé generace (Quantiplex verze 2.0) a v testu Amplicor Monitor 1.0 RT-PCR byly při použití testu bDNA získány konzistentně nižší počty kopií HIV-1. V případě testu bDNA byl počet kopií HIV-1 nižší. Těsná kvantitativní korelace v počtu kopií HIV-1 RNA však byla pozorována mezi testem třetí generace (verze 3.0) a testem Amplicor Monitor 1.5 RT-PCR.18 Výsledky virové zátěže v testu bDNA verze 3.0 a v testu Amplicor RT-PCR byly přibližně 2krát vyšší než v testu verze 2.0. V případě testu bDNA verze 3.0 a v testu Amplicor Monitor 1.5 byly výsledky virové zátěže přibližně 2krát vyšší než v testu verze 2.0. Kvantitativně podobné výsledky v testu bDNA verze 3.0 a v testu RT-PCR jsou důležité v péči o pacienty, protože je pravděpodobné, že při testování vzorků od téhož pacienta v průběhu anti-HIV terapie budou použity různé metody. Nedávné údaje naznačují, že rebaselining u pacientů testovaných pomocí testu RT-PCR nemusí být nutný.

Podobně jako u testu bDNA verze 3.0 na HIV-1 se i u testu bDNA třetí generace na HCV používají oligonukleotidy substituované isoC a isoG, aby se snížila nespecifická hybridizace. Použití oligonukleotidů substituovaných isoC a isoG zvýšilo citlivost testu přibližně 62krát. Dolní mez detekce testu HCV RNA 3.0 byla 3,2 × 103 kopií/ml ve srovnání s 2 × 105 kopií/ml u testu HCV RNA 2.0. Dynamický lineární rozsah kvantifikace testu HCV RNA 3.0 se rozšířil z 3,2 × 103 kopií/ml (615 IU/ml) na 4 × 107 kopií HCV RNA/ml (7,7 × 106 IU/ml). Test HCV RNA 3.0 měl vysokou specificitu (98,2 %) a podobně jako test druhé generace byl stejně účinný při kvantifikaci HCV RNA u všech genotypů. Směrodatné odchylky mezi sériemi pro opakované vzorky byly 0,2 log10 a 0,14 log10, což naznačuje, že test třetí generace byl vysoce reprodukovatelný.

Kromě eradikace HCV v séru je důležitým cílem anti-HCV terapie snížení hladiny HCV v játrech. Užitečnost testu HCV RNA 3.0 pro detekci a kvantifikaci HCV RNA ve vzorcích jaterní biopsie byla studována u 25 pacientů koinfikovaných HCV a HIV.20 Reprodukovatelnost testu HCV bDNA třetí generace byla podobná mezi vzorky jaterní biopsie a séra. Také detekce HCV RNA ve vzorcích jater od pacientů infikovaných genotypy 1, 3 a 4 pomocí testu HCV RNA 3.0 byla vysoce specifická a citlivá. V této studii 25 pacientů korelovaly vysoké hladiny intrahepatálního

HCV před léčbou s nízkou frekvencí odpovědi na anti-HCV terapii. Hladiny intrahepatálního HCV před léčbou byly nejvyšší u pacientů infikovaných HCV genotypu 1. Výsledky této studie prokázaly, že důležité markery progrese onemocnění HCV, hladiny HCV v játrech a v séru, lze spolehlivě kvantifikovat pomocí analýzy bDNA během léčby. Metody pro analýzu bDNA třetí generace zahrnují přípravu vzorku, hybridizaci a detekci signálu proHIV-1 RNA a HCV RNA. Všechny 3 s eps se provádějí v mikrojamkách na platformě System 340 pro test HCV RNA 3.0, který nevyžaduje samostatný krok extrakce. V případě testu HIV-1 RNA verze 3.0 se příprava vzorku liší od metody HCV RNA a provádí se mimo platformu System 340. Nedávná studie hodnotila úpravu metody HIV-1 RNA verze 3.0, v níž byl krok zpracování vzorku HIV-1 upraven tak, aby umožňoval současné testování HCV a HIV-1 na platformě System 340. Metoda HIV-1 byla upravena vynecháním dvouhodinové inkubace při 63 °C pro virovou lýzu. Místo toho byla provedena lýza HIV-1 a HCV na platformě System 340. Metody testování HCV bDNA se v kombinovaném testu nezměnily. Specifičnost a kvantifikace kombinovanou metodou bDNA byly v rámci specifikací pro jednotlivé testy HIV-1 a HCV. Současné testování na HIV-1 a HCV zlepšilo pracovní postupy v klinické laboratoři a vedlo ke snížení nákladů. Vzhledem k tomu, že detekce a kvantifikace HIV-1 RNA a HCV RNA má zásadní význam pro diagnostiku a hodnocení odpovědi na léčbu, představuje možnost provádět simultánní testování na oba viry významný pokrok v molekulární diagnostice.

.