Validace protilátek
Ne všechny protilátky jsou platné pro každý experiment a podmínky, musí být validovány pro konkrétní aplikaci a druh. V současné době neexistuje žádný standardní způsob „validace protilátek“, což může výrazně ovlivnit reprodukovatelnost a spolehlivost experimentů. Časopisy a grantové agentury podnikly kroky k odstranění této mezery. Mnohé z nich nyní mají požadavky na výslovné uvedení způsobu validace protilátky pro konkrétní použití. Bohužel neexistují žádná všeobecně uznávaná kritéria pro validaci protilátek. Je tedy na každém výzkumníkovi, aby validoval každou protilátku pro zamýšlené použití.
Základní validace
Standardní metody validace protilátek zahrnují western blot, ELISA, průtokovou cytometrii a IHC. Většina výzkumných pracovníků si s těmito osvědčenými metodami vystačí. Proces validace může být časově náročný, protože výzkumník nebo výrobce musí validovat protilátku pro každou aplikaci. Tato obtížnost se ještě zvyšuje, protože podmínky každého testu jsou odlišné. Například western blot závisí na denaturaci proteinů. Takže protilátka validovaná pro western blot může fungovat dobře v denaturačních podmínkách, ale může selhat při rozpoznávání antigenů v jejich nativní konformaci (tj. ELISA).1 Podobně protilátka validovaná pro afinitu k nativním proteinům může selhat při vazbě stejného antigenu po denaturaci nebo fixaci.
Výše uvedené metody hrají při validaci protilátek nezbytnou roli. Nelze se však spoléhat pouze na tyto metody, protože nepředstavují stále se rozšiřující aplikace. Úroveň důvěryhodnosti validovaných protilátek lze zvýšit zahrnutím dalších validačních technik.
Staré techniky, nové využití
K řešení nedostatků základní validace protilátek se nedávno sešla skupina vědců, aby „navrhla soubor standardních pokynů pro validaci protilátek“.2 Navrhují, aby se výzkumní pracovníci kromě základních metod validace protilátek začali opírat o koncepční pilíře. Mezi ně patří genetické strategie, strategie nezávislých protilátek a exprese značených proteinů.2
-
Genetické strategie: CRISPR-Cas9 a další
Genetické strategie se skládají z technik, jako je CRISPR-Cas9, RNAi a siRNA knockdown, používaných ve spojení s testem detekce proteinu. Tyto metody detekují jakoukoli nespecifickou vazbu dané protilátky po vyřazení nebo snížení příslušného genu. Pokud je protilátka specifická, pak by ve vyřazených, respektive snížených buněčných liniích neměl být detekován žádný nebo snížený signál protilátky.
-
Přístup nezávislých protilátek
Použití nezávislých protilátek je další metodou, která by mohla odhalit nespecifickou vazbu. Přístup nezávislých protilátek využívá dvě různé (nezávislé) protilátky, které vážou stejný antigen, ale různé epitopy. Proto by tyto dvě protilátky měly vykazovat stejný detekční vzorec a žádnou necílovou vazbu.2 Tato technika vyžaduje pro testování více vzorků, aby bylo možné kontrolovat proměnlivou expresi cílového proteinu, což by mohlo být nákladné a časově náročné.2 Navíc tato validační technika závisí na dostupnosti více protilátek, které rozpoznávají různé epitopy na stejném cílovém proteinu. GenScript nabízí binning epitopů ve službáchMonoExpress™ mAb, které zahrnují „nezávislé protilátky“ pro proteinové antigeny.
-
Exprese značených proteinů
Analýza detekce značených cílových proteinů může také poskytnout způsob, jak měřit nespecifickou vazbu protilátek. Při této metodě jsou cílové proteiny modifikovány buď afinitní značkou (tj. FLAG), nebo fluorescenčním proteinem (tj. GFP). Poté se podobně jako u metody nezávislé protilátky porovná detekční vzorec validované protilátky s detekčním vzorkem protilátky specifické pro značku. Tato metoda je sice jednoduchá, ale jedním z problémů je zajistit, aby byly značené proteiny exprimovány na endogenní úrovni, protože „nadměrná exprese by mohla maskovat detekci vazeb mimo cíl“.2
Rekombinantní protilátky jako alternativa k monoklonálním protilátkám?
Nedávná výzva týkající se validace protilátek navrhla, aby výzkumní pracovníci používali pouze rekombinantní protilátky namísto polyklonálních nebo dokonce monoklonálních protilátek. Monoklonální protilátky se vyrábějípomocí hybridomových buněčných linií. Bohužel hybridomové buněčné linie mohou odumřít, ztratit své geny kódující protilátky nebo nerostou, když jsou vyjmuty ze zmrazeného skladu.3 Navíc monoklonální protilátky produkované hybridomy se mohou vázat na více než jeden cíl. Určení sekvence protilátky kódované hybridomem a rekombinantní výroba protilátky proto tyto problémy překonává. Také díky definované sekvenci mohou rekombinantní protilátky poskytnout další vrstvu validace ve srovnání s použitím pouze výše uvedených technik.3
Tyto další validační metody navrhují „poskytnout důkaz, že protilátka váže svůj cíl, a ve většině případů by měly také umožnit vyhodnocení potenciální zkřížené reaktivity za testovaných podmínek“.2 Pro správnou validaci protilátek však bude pravděpodobně nutné provést kombinaci starých a nových strategií.
Výběr vhodné metody validace protilátek
S ohledem na všechny tyto otázky týkající se protilátek, jak vybrat vhodnou metodu?
Nejprve se musíte rozhodnout, ve kterém testu protilátku použijete. Například metoda CRISPR-Cas9 nezahrnuje modifikaci cílového proteinu a ověřuje, že protilátka nemá zkříženou reaktivitu s jinými proteiny. Tuto techniku tedy můžete použít k validaci protilátek pro širokou škálu testů, včetně western blotu, IHC, imunocytochemie (ICC), průtokové cytometrie, ELISA, imunoprecipitace (IP), chromatinové imunoprecipitace (ChIP) a proteinových testů na reverzní fázi.2 Vzhledem k obtížím s expresí modifikovaného proteinu se však validace protilátky pomocí exprese značeného proteinu navrhuje pouze pro western bloty, IHC, ICC a průtokovou cytometrii.
Za druhé, výzkumník si musí být vědom omezení vzorků u těchto validačních metod. Jako příklad lze uvést, že techniky CRISPR-Cas9/KO i exprese značených proteinů nelze použít k validaci protilátek ve vzorcích lidských tkání a tělních tekutin, jako je plazma a sérum.2 To proto, že na rozdíl od buněčných linií nelze u lidí provádět genetickou manipulaci.2
Nakonec, bez ohledu na protilátku a příslušnou validační metodu použitou poskytovatelem protilátek, musí výzkumník provést alespoň jednu validační strategii ve své konkrétní aplikaci nebo v kontextu vzorku.2
Validace každé protilátky pro vaši konkrétní aplikaci a druh je klíčem k dosažení reprodukovatelných a spolehlivých výsledků. Tyto informace vám pomohou při rozhodování o vhodných metodách pro použití ve vaší laboratoři. Další pomoc s validací protilátek nebo jinými aplikacemi naleznete na stránceGenScript Antibody Technical Resources.
Převzato z obsahu vytvořeného společností BitesizeBio jménem společnosti GenScript.