Variabilita alozymů v přírodní populaci Stryphnodendron adstringens ve státním parku Rio Preto v jihovýchodní Brazílii

BIOCHEMIE A FYZIOLOGIE

Variabilita alozymů v přírodní populaci Stryphnodendron adstringens ve státním parku Rio Preto v jihovýchodní Brazílii

Jacqueline Siqueira GlasenappI,*; Priscila Barros BarbosaI; Vicente Wagner Dias CasaliI; Ernane Ronie MartinsII; Cosme Damião CruzIII

IUniversidade Federal de Viçosa, Departamento de Fitotecnia, Av. PH Rolfs s/n, 36570-000 Viçosa, MG, Brazílie
IIUniversidade Federal de Minas Gerais, Instituto de Ciências Agrárias, Avenida Universitária 1.000, Bairro Universitário, Montes Claros, 39404-547 MG, Brazílie
IIIUniversidade Federal de Viçosa, Departamento de Biologia, Av. PH Rolfs s/n, 36570-000 Viçosa, MG, Brazil

ABSTRACT

Ve státním parku Rio Preto byly odebrány vzorky listů a plodů z 63 stromů Stryphnodendron adstringens za účelem analýzy alozymové segregace, tkáňově specifické exprese alozymových lokusů a jejich genetických parametrů. Enzymové systémy ADH, EST, ACP, PGM, PGI, GDH, G6PDH, GOT, IDH, LAP, MDH, PER a SKDH byly hodnoceny pomocí elektroforézy na škrobovém gelu. Polymorfní systémy PGI, IDH, MDH a GOT vykazovaly dimerní kvartérní strukturu, zatímco EST a PER byly monomerní. Celková očekávaná genetická diverzita (HE) pro listy a semena byla 0,325, resp. 0,244. Efektivní počet alel na lokus (AE) byl 1,58 u listů a 1,42 u semen. Hodnoty HE a AE zjištěné u S. adstringens byly relativně vyšší než průměrné hodnoty zjištěné v alozymových studiích jiných dřevin. Hodnoty fixačních indexů pro populaci s ohledem na listy (f = 0,070) a semena (f = 0,107) nebyly významné. Vysoké hodnoty genetické diverzity a efektivního počtu alel na lokus, stejně jako nesignifikantní index fixace a úpravy Hardy-Weinbergových proporcí mezi generacemi pro lokusy pgi-1, mdh-2 a idh-1 ukazují na náhodné páření v této populaci. Enzymové systémy EST a PER prokázaly nejlepší rozlišení v listových pletivech, zatímco systémy MDH, IDH, PGI a GOT prokázaly nejlepší rozlišení v pletivech semen.

Klíčová slova: alozymová segregace, genetická diverzita, heterozygotnost, léčivé rostliny

ÚVOD

Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville (Mimosoideae, Leguminosae) je malý stálezelený strom (místně nazývaný barbatimão), který je široce rozšířen v biomu Cerrado (brazilské savany) (Ortiz et al. 2003). V tradiční medicíně se používá k léčbě neduhů, jako jsou vředy, boláky, hemoroidy (Barros 1982), gastritida, bolesti v krku (Hirschmann & Arias 1990), leukorea, hernie, průjem, krvácení, pásový opar a oftalmie (Pio Correa 1926, Almeida et al. 1998). Její hroznovitá andromonická květenství mají malé a hustě uspořádané květy. Pro produkci plodů je u tohoto druhu nezbytné křížové opylení a zdá se, že hlavními květními návštěvníky jsou blanokřídlí (Hymenoptera); mezi další květní návštěvníky patří dvoukřídlí (Diptera), motýli (Lepidoptera) a brouci (Coleoptera). Produkce plodů je omezena dostupností zdrojů (Ortiz et al. 2003).

Populace Stryphnodendron adstringens, které dříve pokrývaly rozsáhlé oblasti Cerrado, jsou nyní izolovány v malých fragmentech v důsledku odlesňování, nevybíravého využívání půdy a rozvoje měst. Jednou z mála oblastí, kde je vegetace Cerrado ještě dobře zachována, je státní park Rio Preto (RPSP), který se nachází v obci São Gonçalo do Rio Preto v biosférické rezervaci Serra do Espinhaço, 70 km od města Diamantina ve státě Minas Gerais na jihovýchodě Brazílie. Park se rozkládá na celkové ploše 12 185 ha, kterou pokrývá převážně vegetace cerrado sensu stricto a campos de altitude. Fauna a flóra v RPSP je velmi bohatá a zahrnuje mnoho ohrožených druhů, například S. adstringens (IEF 2011). Pohoří Espinhaço slouží jako rozvodí povodí mnoha středovýchodních řek i velké řeky São Francisco (Saadi 1995) a ve své střední a jižní části odděluje dva významné biomy: atlantský deštný les na východních svazích a biom Cerrado na západních svazích (Melo Júnior et al. 2001).

Genetické zdroje léčivých rostlin (zejména dřevin) jsou omezené a mnohé rostliny Cerrado byly hojně využívány, aniž by se dbalo na jejich zachování nebo obnovu. Je nezbytné, aby naše zbývající lesní zdroje byly využívány uvážlivě – a genetické studie jsou zásadní pro úplné pochopení jejich evolučních procesů a pro vypracování ochranářských strategií, které mohou zaručit budoucnost spravovaných druhů. Izozymové techniky umožňují zjišťovat úroveň genetické variability v přirozených populacích tropických lesních dřevin a měřit populační procesy důležité pro ekology, ochranáře a pracovníky lesního hospodářství (Loveless 1992). Je však k dispozici jen velmi málo studií úrovně genetických variací u dřevin Cerrado. Byly publikovány dvě studie genetické diverzity u S. adstringens, první byla založena na mikrosatelitních datech (Branco et al. 2010) a druhá na RAPD markerech (Camillo et al. 2001), ale nebyly zaznamenány žádné izozymové studie.

Vzhledem k tomu, že geny, které řídí expresi izozymů, se projevují v určitých vývojových stadiích a ve specifických orgánech a tkáních nebo v reakci na určité podněty (Ramírez et al. 1991), mohou se zymogramy z extraktů semen, semenáčků a listů dospělých rostlin značně lišit (Alfenas & Brune 1998). Mnoho enzymů, jako jsou esterázy, peroxidázy, fosfatázy a peptidázy, také vykazovalo vývojové a environmentální variace, které napodobují mendelovskou segregaci (Conckle 1971b, Kelley & Adamns 1977) a buď genetické (Law 1967), nebo environmentální posttranslační modifikace (Cullis 1977), takže mendelovské analýzy jsou nezbytné při studiu nespecifických enzymových testů (Hart & Langston 1977). Nejlepším způsobem, jak tento problém řešit, je ověřit pomocí mendelovských analýz, že daný soubor izozymových variant jsou skutečné alozymy, tj. že jsou kódovány různými alelami na stejném lokusu (Broun & Moran 1979).

Cílem této studie bylo vyhodnotit tkáňově specifickou expresi a segregaci alozymových lokusů, změřit genetické parametry a popsat užitečné alozymové varianty pro budoucí hodnocení genetické struktury populací S. adstringens.

MATERIÁL A METODY

Vegetace v rezervaci RPSP je dobře zachovalá a S. adstringens je velmi běžný uvnitř i vně parku, vyskytuje se téměř souvisle v obcích Olhos D’Água a Diamantina, stát Minas Gerais, Brazílie. Byly odebrány vzorky listů a plodů (v závěrečné fázi zrání) z 63 jednotlivých stromů S. adstringens. Průměrná vzdálenost mezi odebranými stromy byla 60 m. Plody byly přepravovány v papírových sáčcích a listy byly ponořeny do kapalného dusíku, dokud nebyly analyzovány v Laboratoři reprodukce rostlin Federální univerzity ve Viçose.

Tato studie se zaměřila na izozymové varianty (alozymy) přítomné v této populaci S. adstringens. Analýzy byly provedeny technikou elektroforézy na škrobovém gelu, přičemž alozymy byly extrahovány z listů a tří semen z každého odebraného stromu. Byly použity poměry 1 g listové tkáně nebo jednoho semene na každé 3 ml extrakčního roztoku č. 1, jak doporučují Alfenas et al. (2006). Gely byly připraveny z 12 g sacharózy a 60 g škrobu na 500 ml gelového pufrovacího roztoku. Použité pufrovací systémy se řídily Soltisem et al. (1983) (pufr A) a Shawem & Prasadem (1970) (pufr B). Předběžný běh byl proveden při 15 mA po dobu 30 min. s pufrem A a po dobu 1 h s pufrem B. Extrakční běhy byly provedeny při 35 mA a trvaly přibližně 5 h. Analyzované alozymové systémy a složení elektrodových/gelových pufrových systémů jsou popsány v tabulce 1.

Zymogramy byly analyzovány a alozymové lokusy identifikovány pomocí stejných zkratek používaných pro označení každého enzymového systému (například PGI pro fosfoglukózovou izomerázu) malými písmeny v kurzívě, následovaných jeho vzestupným číselným pořadím počínaje pomaleji migrujícím lokusem (například pgi-1). Nejrychleji migrující alela na každém lokusu byla označena písmenem a, zatímco pomaleji migrující alely následovaly v abecedním pořadí. Statistické testy zahrnující frekvence alel byly provedeny pouze u lokusů, které vykazovaly jednoduché vzory pásů, jež bylo možné snadno identifikovat.

K testování mendelovské dědičnosti a správné interpretaci zymogramů jsou nutné řízené křížící pokusy nebo alozymové studie s použitím haploidních tkání (např. pylu) (Hart & Langston 1977, Broun & Moran 1979, Alfenas & Brune 1998). Tyto studie je obtížné provádět u S. adstringens, protože je to nedomestikovaná, alogamní a pomalu rostoucí rostlina a většina jejích ramet nevytvořila plody samoopylením (Rocha & Moraes 1997, Ortiz et al. 2003).

Brown & Moran (1979) poznamenávají, že nejlepší způsob, jak se vyhnout nesprávné interpretaci izozymových dat, je použít mendelovské analýzy k ověření, že soubory izozymových variant jsou skutečně alozymy a že jsou kódovány alelami na jednom lokusu. Proto jsme za účelem správné identifikace způsobů dědičnosti alozymů bez provádění genetických křížení nebo studií haploidních tkání analyzovali genotypové poměry alozymů mezi generacemi měřením frekvencí alel listů a semen z téže rostliny. Na základě zjištěných frekvencí alel v listech ze 63 stromů jsme vypočítali očekávané frekvence genotypů při Hardy-Weinbergově rovnováze (HWE) pro stejně velký vzorek potomstva (189 semen). Jednotlivá semena nebo semenáčky lze testovat jako členy potomstva (Brown & Moran 1979). Očekávané frekvence alel potomstva byly poté porovnány se stejně velkým vzorkem testovaného potomstva pomocí chí-kvadrát testu (X2). Vzhledem k tomu, že tento druh je alogamní a samčí rodiče nejsou známi, byli jedinci samotné populace považováni za jedince tvořící samčí gametovou sadu (Cruz 2005), a frekvence samčích alel byly proto za předpokladu HWE považovány za stejné jako u samic.

Byly odhadnuty genetické parametry efektivního počtu alel, genetická diverzita (HE a HO) (Nei 1973) a index fixace (Wright 1951). Očekávaný podíl heterozygotních lokusů na jedince (HE) je složená míra, která shrnuje genetickou variabilitu na úrovni alel. Tento parametr, který se často označuje jako genetická diverzita, byl vypočten pro každý lokus a zprůměrován pro všechny lokusy (Berg & Hamrick 1997). Byl proveden Li & Horvitzův (1953) test indexu fixace (f). Každý lokus byl testován zvlášť a hodnota χ2 a df byly sečteny za všechny lokusy, čímž byl získán celkový test průměrného multilokusového f. Statistické analýzy byly provedeny pomocí softwarového systému Genes pro genetiku a statistiku. K výpočtu pravděpodobností genotypového uspořádání pozorovaného v listech a semenech byly použity Fisherovy přesné testy a testy chí-kvadrát (χ2 ).

VÝSLEDKY A DISKUSE

U polymorfních systémů malátdehydrogenázy (MDH), fosfoglukózaizomerázy (PGI), isocitrátdehydrogenázy (IDH), glutamátoxaloacetáttransaminázy (GOT), peroxidázy (PER) a esterázy (EST) byly mezi listy a semeny pozorovány rozdíly, pokud jde o aktivní oblasti a počty lokusů a alel; na druhé straně systémy PGI, IDH, EST a SKDH vykazovaly aktivitu ve stejných lokusech. Aktivní oblasti, počet lokusů, počet alel, kvartérní struktura pozorovaná u polymorfních systémů a kvartérní struktury zaznamenané v literatuře jsou uvedeny v tabulce 2. Schematické znázornění variability polymorfních systémů použitých ve statistických analýzách (PGI, IDH, GOT a PER) je uvedeno na obrázku 1.

Dvě oblasti aktivity MDH byly patrné v gelech listů (samičích rodičů), zatímco v gelech semen (potomků) byla patrná pouze jedna oblast. Katodální oblast aktivity byla pozorována hlavně v listech a zdálo se, že je řízena jediným lokusem (mdh-1); vykazovala monomerní izozymový vzorec na rozdíl od obvykle pozorovaných dimerních nebo tetramerních vzorců (Brune et al. 2006). Monomorfní lokus mdh-2 v anodální oblasti byl patrný pouze v semenech a dimerní lokus mdh-3 se shodoval v listech a semenech a vykazoval dimerní vzorec se dvěma alelami, které byly jasně a konzistentně pozorovány v obou orgánech. MDH byl izolován z různých zdrojů, včetně archeí, eubakterií, hub, rostlin a savců, a byl popsán jako složený ze dvou nebo čtyř podjednotek (Musrati et al. 1998, Brune et al. 2006).

Dvě shodné aktivní oblasti byly pozorovány v gelech PGI v listech i semenech, které byly zřejmě řízeny jedním lokusem a každá dvěma alelami. Lokus pgi-1 vykazoval dimerický vzorec s hybridními pásy typickými pro heterozygotní jedince a dvě alely. Anodální (pgi-2) lokus vykazoval pásový vzor typický pro monomerní enzymy. Ačkoli byl u mikroorganismů, jako je Archaeoglobus fulgidus a Methanosarcina mazei, pozorován monomerní vzor PGI (Hansen et al. 2005), je tento enzym obecně dimerní (Cini et al. 1988, Tekamp-Olson et al. 1988, Sun et al. 1990, Brune et al. 2006). Gely IDH z listů a semen prokázaly zónu aktivity řízenou lokusem (idh-1) se třemi alelami. Enzym IDH byl dobře prozkoumán u hub a živočichů a je obvykle dimerní nebo oligomerní (Brune et al. 2006); dimerní struktura byla potvrzena u rostlin, jako je Cucumis sativus (Watanabe et al. 2007) a třešeň (Granger et al. 1992). GOT gely ukázaly dvě aktivní oblasti v semenech a jednu aktivní oblast v listech. Anodální oblast vykazovala vzorec dvou fixních pásů, které byly patrné jak v listech, tak v semenech (got-2 a got-3). Aktivní katodální oblast z extraktů semen vykazovala pouze jeden lokus (got-1) se dvěma alelami a dimerním vzorem pásů. Je známo, že alozymy GOT mají u rostlin dimerický vzorec (Kephart 1990).

Tři aktivní oblasti byly pozorovány v PER gelech z listů a dvě aktivní oblasti byly pozorovány v gelech ze semen. Ačkoli se pásové vzorce potomků (semen) shodovaly s pásovými vzorci stromů (listů), porovnání mezi listy a semeny nebylo možné kvůli špatnému rozlišení většiny jedinců potomků. V každé anodální a intermediální oblasti listových extraktů byl patrný monomerní vzorec s jedním lokusem (per-1 a per-2) a dvěma alelami, což je v souladu s výsledky Brune et al. (2006). Třešeň prokázala dimerní kvartérní strukturu (Granger et al. 1992), ale monomery byly pozorovány u Cucumis sativus, Roystonea regia (Watanabe et al. 2007) a Allium sativum (Marzouki et al. 2005).

V gelech EST byly patrné tři aktivní oblasti, a přestože počet lokusů a alel byl stejný pro listy i semena, vzorce pásů nebyly u všech jedinců dostatečně jasné, aby umožnily statistické analýzy. Byl pozorován monomerní vzorec s jedním lokusem a dvěma alelami v každé anodální a intermediální oblasti, zatímco v katodální oblasti byly pozorovány dva fixní lokusy. Esterázy jsou jedním z nejvíce polymorfních enzymových systémů u rostlin (Weeden & Wendel 1990) a nejvíce zkoumaným systémem u rýže (Endo & Morishma 1983) a u rostlin se obvykle vyskytují monomerní nebo dimerní varianty těchto enzymů (Brune et al. 2006). V této studii byly v gelech jasně a konzistentně pozorovány pouze pásové vzorce lokusů got-1, idh-1, pgi1, mdh-2, per-1 a per-2, které bylo možné použít pro statistické účely. Velikosti vzorků a frekvence alel analyzovaných polymorfních lokusů jsou uvedeny v tabulce 3.

Achromatické pásy bez zjistitelných vzorců rozložení byly pozorovány u glukózové dehydrogenázy (GDH), alkoholdehydrogenázy (ADH) a glukózo-6-fosfátdehydrogenázy (G6PDH). V genech potomků ADH byla pozorována jedna aktivní oblast s pevným vzorem triplexních pásů; pásy se lišily v intenzitě zbarvení a pomaleji migrující pásy byly obecně intenzivněji zbarvené. V gelech potomků GDH byla pozorována jedna aktivní oblast s pevným vzorem pěti po sobě jdoucích pásů, přičemž třetí a pátý pás vykazoval mnohem hlubší intenzitu barvy. Enzymové systémy leucinaminopeptidáza (LAP), fosfoglukomutáza (PGM), šikimátdehydrogenáza (SKDH) a kyselá fosfatáza (ACP) byly monomorfní.

Překvapivě testy přizpůsobení poměrům HWE a Fisherův a χ2 test byly nesignifikantní pro všechny analyzované alozymové systémy v různých typech tkání a mezi generacemi (tabulky 4, 5). Je však třeba poznamenat, že u testů HWE (stejně jako u jakéhokoli jiného statistického testu) nemusí neschopnost zamítnout nulovou hypotézu nutně znamenat její platnost. Je možné, že genotypové frekvence v populacích, v nichž nedochází k náhodnému páření, jsou rozloženy tak, že napodobují multinomické rozdělení (Li 1988). Je také možné, že faktory, které způsobují odchylky od očekávání HWE, vedou genotypové frekvence opačným směrem, přičemž konečné výsledky mezi počtem pozorovaných a očekávaných genotypů nejsou významné (Workman 1969, Cavalli-Sforza & Bodmer 1971).

Zralé plody S. adstringens jsou intenzivně napadány několika druhy hmyzu a v každém lusku zůstává jen málo semen nebo dokonce žádná (Branco et al. 2009) a není známo, zda se na této predaci podílí selektivní faktor prostředí nebo zda je směrová. Protože však byly odebírány plody v posledním stadiu zrání a semena použitá k odhadu frekvencí alel potomstva nebyla vystavena žádnému domnělému selekčnímu tlaku, mohlo to vést k nesignifikantním výsledkům. Lze předpokládat, že tyto výsledky by byly jiné, kdyby byla použita pouze zralá semena (která byla vystavena přirozenému selekčnímu tlaku). Dalším bodem, který je třeba vzít v úvahu, je, že v této studii se předpokládala rovnost mezi frekvencemi alel samců a samic. Pozorovaná HWE mezi generacemi by tedy nemusela být skutečná, pokud by se frekvence alel mezi samčími a samičími gametami ve skutečnosti lišily. Outcrossing v populacích s nízkou efektivní velikostí může sloužit jako mechanismus pro akumulaci nadbytečných heterozygotů, přičemž alelické frekvence mezi samci a samicemi v malé populaci se liší pouze náhodou (Balloux 2004, Souza et al. 2004) v důsledku driftových procesů, které vedou k častějšímu křížení jedinců nesoucích různé alely.

Genetická diverzita (HE), efektivní počet alel na lokus (AE), pozorovaná heterozygotnost (HO) a index fixace (f) měřených polymorfních lokusů jsou uvedeny v tabulce 6. Lokus idh-1 vykazoval nejvyšší hodnoty HE v listech (0,535) a semenech (0,532). Tento výsledek byl očekáván v důsledku vyššího počtu alel v idh-1 než v ostatních polymorfních lokusech. Nejmenší hodnoty byly pozorovány u mdh-2 (HE = 0,106) a got-1 (HE = 0,125) v listech a semenech. Celková očekávaná genetická diverzita při zohlednění všech lokusů byla 0,325 u listů a 0,244 u semen. Efektivní počet alel na lokus (AE) pro populaci byl 1,58 v listech a 1,42 v semenech. Hodnoty AE zjištěné u S. adstringens byly vyšší a hodnoty HE nižší než průměrné hodnoty uváděné v alozymových studiích, které shromáždili Hamrick et al. (1992), kteří hodnotili dřeviny. Dlouhověké dřeviny mají v průměru vyšší efektivní počet alel na lokus (AE = 1,24) a větší genetickou diverzitu (HE = 0,177) než ostatní formy života. Hodnoty f naměřené u S. adstringens byly nesignifikantní pro všechny lokusy s ohledem na listy (f = 0,070) a semena (f = 0,107). Nicméně pravděpodobnost nesignifikantnosti indexu fixace semen (P = 0,0918) byla relativně menší než u listů (P = 0,8653). Celkový index fixace zjištěný pro listy a semena byl podstatně menší než index zjištěný pomocí mikrosatelitních dat (f = 0,3529) (Branco et al. 2009). Tyto rozdíly byly způsobeny vyšším počtem alel na lokus mikrosatelitních markerů, což zvýšilo počet očekávaných heterozygotních lokusů a následně zvýšilo kladné hodnoty genetického parametru f.

Vyšší hodnoty genetické diverzity a efektivního počtu alel na lokus, nevýznamný index fixace a úpravy proporcí HWE mezi generacemi pozorované u lokusů pgi-1, mdh-2 a idh-1 naznačují náhodné páření v této populaci S. adstringens. Alozymové systémy EST a PER byly jasněji určeny v listové tkáni, zatímco systémy MDH, IDH, PGI a GOT byly jasněji určeny v semenné tkáni.

Poděkování – Autoři děkují Fundação de Amparo a Pesquisa de Minas Gerais (Fapemig) a Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) za finanční podporu a za doktorandské a vědecké iniciační stipendium; Instituto Estadual de Florestas (IEF) a Instituto de Ciências Agronômicas (ICA) na Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG).

Adams WT, Joly EJ. 1980. Genetics of allozyme variants in loblolly pine [Genetika alozymových variant u borovice lesní]. Journal of Heredity 71:33-40.

Alfenas AC, Brune W. 1998. Eletroforese em gel de amido. In Eletroforese de isoenzimas e proteínas afins: fundamentos e aplicações em plantas e microorganismos (AC Alfenas, ed.). Editora Universidade Federal de Viçosa – UFV, Viçosa, s. 47-63.

Alfenas AC, Dusi A, Zerbini Júnior FM, Robinson IP, Micales JA, Oliveira JR, Dias LAS, Scortichini M, Pereira MCB, Bonde RB, Alonso SK, Junghans TG, Brune W. 2006. Eletroforese e marcadores bioquímicos em plantas e microorganismos. 2 ed., Editora Universidade Federal de Viçosa – UFV, Viçosa, s.85-148.

Almeida SP, Proença CEB, Sano SM, Ribeiro JF. 1998. Cerrado: užitečné druhy rostlin. Embrapa-CPAC, Planaltina.

Balloux F. 2004. Nadbytek heterozygotů v malých populacích a efektivní velikost populace s nadbytkem heterozygotů. Evolution 58:1891-1900.

Barros MAG. 1982. Léčivá flóra federálního distriktu. Brasil Florestal 12:35-45.

Berg EE, Hamrick JL. 1997. Kvantifikace genetické diverzity na alozymových lokusech. Canadian Journal of Forest Research 27:215-424.

Branco EA, Zimback L, Lima AB, Mori ES, Aoki H. 2009. Genetická struktura populací Stryphnodendron astringens (Mart.). 4º Seminário de Iniciação Científica do Instituto florestal, 24. června 2010. Federální institut – IF Records Series 42-37.

Brown AHD, Moran GF. 1979. Izozymy a genetické zdroje lesních dřevin. In Proceedings of the Symposium on Isozymes of North American Forest Trees and Forest Insects (MT Conkle, Technical Coord.). Pacific Southwest Forest and Range Experiment Station, Berkeley, s. 1-10.

Brune W, Alfenas AC, Junghan, TG. 2006. Specifická identifikace enzymů v gelech. In Electrophoresis and biochemical markers in plants and microorganisms (AC Alfenas, ed). Editora Universidade Federal de Viçosa – UFV, Viçosa, s.202-328.

Camillo J, Ciampi A, Vieira RF. 2001. Analýza genetické variability barbatimão (Stryphnodendron astringens) pomocí RAPD markerů. In Anais do Encontro do Talento Estudantil da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 6, Brasília, DF. Embrapa Genetické zdroje a biotechnologie, Brasilia, s. 50.

Cavalli-Sforza LL, Bodmer WF. 1971. Genetika lidských populací. W.H. Freeman and Company, San Francisco.

Cini JK, Cook PF, Gracy RW. 1988. Molekulární základ alozymů hovězí glukóza-6-fosfát izomerázy. Archives of Biochemistry and Biophysics 263:96-106.

Cruz CD. 2005. Princípios de genética quantitativa. Editora Universidade Federal de Viçosa – UFV, Viçosa, s.252-254.

Cullis CA. 1977. Molekulární aspekty environmentální indukce dědičných změn u lnu. Heredity 38:129-154.

Endo T, Morishma, H. 1983. Rýže. In Isozymes in plant genetics and breeding (SD Tanksley, TJ Ortton, eds.). Elsevier, Amsterdam, část B, s. 129-146.

Granger AR, Clarke GR, Jacson JF. 1993. Identifikace třešní pomocí polymorfismu listových alozymů. Theoretical and Applied Genetics 86:458-464.

Hamrick JL, Godt MJW, Sherman-Broyles S. 1992. Faktory ovlivňující úroveň genetické diverzity u dřevin. New Forest 6:95-124.

Hansen T, Schlichting B, Felgendreher M, Schonheit PJ. 2005. Fosfoglukózové izomerázy kupinového typu (Cupin-PGI) představují novou rodinu PGI závislých na kovech, která představuje konvergentní linii evoluce PGI. Journal of Bacteriology 187:1621-1631.

Har GE, Langston PJ. 1977. Chromozomální umístění a evoluce strukturních genů izozymů u hexaploidní pšenice. Heredity 39:263-277.

Hirschmann GS, Arias AR. 1990. A survey of medicinal plants of Minas Gerais, Brazil (Průzkum léčivých rostlin v Minas Gerais, Brazílie). Journal of Ethnopharmacology 29:159-172.

Kelley WA, Adams RP. 1977. Seasonal variation of allozymes in Juniperius scopulorum: systematic significance. American Journal of Botany 64:1092-1096.

Kephart SR. 1990. Starch-gel electrophoresis of plant allozymes a comparative analysis of techniques [Elektroforéza rostlinných alozymů na škrobovém gelu – srovnávací analýza technik]. American Journal of Botany 77:693-712.

Law GRJ. 1967. Asociace alkalické fosfatázy a leucinaminopeptidázy v plazmě kuřete. Science 156:1106-1107.

Li CC, Horvitz DG. 1953. Některé metody odhadu koeficientu příbuzenské plemenitby. American Journal of Human Genetics 5:107-117.

Li CC. 1988. Populace s pseudonáhodným párováním. Na oslavu 80. výročí Hardyho-Weinbergova zákona. Genetics 119:731-737.

Loveless MD. 1992. Isozymová variabilita u tropických stromů: vzorce genetické organizace. New Forests 6:67-94.

Marzouki SM, Limam F, Smaali MI, Ulber R, Marzouki MN. 2005. Nová termostabilní peroxidáza z česneku Allium sativum: purifikace, biochemické vlastnosti, imobilizace a použití při detekci H2O2 v mléce. Applied Biochemistry and Biotechnology 127:201-214.

Melo Júnior TA, Vasconcelos MF, Fernandes GW, Marini MA. 2001. Rozšíření a ochrana ptačích druhů v Serra do Cipó, Minas Gerais, Brazílie. Bird Conservation International 11:189-204.

Minas Gerais. Secretaria de Estado de Meio Ambiente e Desenvolvimento Sustentável. Instituto Estadual de Florestas. http://www.ief.mg.gov.br/component/content/196?task=view (navštíveno 12. února 2011).

Musrati RA, Kollárová M, Mernik N, Mikulásová D. 1998. Malátdehydrogenáza: distribuce, funkce a vlastnosti. Obecná fyziologie a biofyzika 17:193-210.

Nei M. 1973. Analýza genové diverzity v dílčích populacích. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 70:3321-3323.

Ortiz PL, Arista M, Oliveira PE, Talavera S. 2003. Vzorce tvorby květů a plodů u Stryphnodendron astringens, andromonoecious legume tree of Central Brazil. Biologie rostlin 5:592-599.

Pio Corrêa M. 1926. Dicionário de plantas úteis do Brasil e das exóticas cultivadas. Imprensa Oficial, Rio de Janeiro, v.1.

Ramirez H, Calderon A, RoccaW. 1991. Técnicas moleculares para evaluar y mejorar el germoplasma vegetal. In Cultivo de tejidos en la agricultura: fundamentos y aplicaciones (W Rocca, L Mroginski, eds.). Mezinárodní centrum pro tropické zemědělství – CIAT, Cali, s.825-856.

Rocha AMS, Moraes JAPV. 1997. Vliv vodního stresu na výměnu plynů u mladých hrnkových rostlin Stryphnodendron astringens (Mart.) Coville. Brazilian Journal of Plant Physiology 9:41-46.

Saadi A. 1995. Geomorfologie pohoří Espinhaço v Minas Gerais a jeho okrajů. Geonomos 3:41-63.

Shaw CR, Prasad R. 1970. Starch gel electrophoresis of enzymes: a compilation of recipes [Škrobová gelová elektroforéza enzymů: sborník receptů]. Biochemická genetika 4:297-320.

Soltis DE, Haufler CH, Darrow DC, Gastony GJ. 1983. Škrobová gelová elektroforéza kapradin: kompilace rozmělňovacích pufrů, gelových a elektrodových pufrů a rozpisů barvení. American Fern Journal 73:9-27.

Sousa VA, Robinson IP, Hattemer HH. 2004. Variabilita a struktura populací v enzymových genových lokusech u Araucaria angustifolia (Bert.) O. Ktze. Silvae Genetica 53:12-19.

Sun AQ, Yuksel K, Jacobson TM, Grac RW. 1990. Isolation and characterization of human glucose-6-phosphate isomerase isoforms containing two different size subunits. Archives of Biochemistry and Biophysics 283:120-129.

Tekamp-Olson P, Najarian R, Burke RL. 1988. Izolace, charakterizace a nukleotidová sekvence genu fosfoglukoizomerázy Saccharomyces cerevisiae. Gene 73:153-161.

Watanabe L, Nascimento AS, Zamorano LS, Shnyrov VL, Polikarpov I. 2007. Purifikace, krystalizace a předběžná rentgenová difrakční analýza peroxidázy palmy královské (Roystonea regia). Acta Crystallographica, Section F, Structural Biology and Crystallization Communications 63:780-783.

Weeden NF, Wendel JF. 1990. Genetika rostlinných alozymů. In Allozymes in plant biology (DE Soltis, PS Soltis, eds.). Chapman and Hall, London, s. 46-72.

Workman PL. 1969. Analýza jednoduchého genetického polymorfismu. Human Biology 41:97-114.

Wright S. 1951. Obecná struktura populací. Annals of Eugenics 15:323-354.