Zvýšená alkalická fosfatáza u pacienta s rakovinou:

Prezentace případu

Pětačtyřicetiletý muž s recidivujícím metastazujícím Ewingovým sarkomem se dostavil do Memorial Sloan Kettering Cancer Center za účelem možného zařazení do klinické studie. Počáteční laboratorní výsledky se vyznačovaly zvýšenou hladinou alkalické fosfatázy a γ-glutamyltransferázy, ale jinak byly bez pozoruhodností, včetně normálních hladin aspartátaminotransferázy (AST) a alanintransferázy (ALT). Zvýšené hladiny ALP a GGT naznačovaly onemocnění jater, ačkoli pacient neměl v anamnéze žádné předchozí jaterní abnormality. Vzhledem k tomu, že pacientka měla v anamnéze metastatické onemocnění kostí, vzniklo podezření, že pozorované zvýšení ALP bylo způsobeno zvýšeným kostním izoenzymem ALP. Bylo však důležité zdokumentovat původ zvýšeného ALP, protože pacient měl být zařazen do výzkumné studie, která měla definovat dávkování a nežádoucí účinky léku. Zvýšení ALP v průběhu studie, které by bylo způsobeno jaterně specifickými izoenzymy, by bylo hlášeno jako toxicita omezující dávku a mohlo by oddálit léčbu nebo potenciálně vyloučit pacienta z klinické studie. Naopak zvýšení ALP pocházející z kostí a sekundární k onemocnění by nebylo hlášeno jako toxicita.

Laboratoř byla konzultována ohledně možností testování k identifikaci specifického izoenzymu (izoenzymů) zodpovědného (zodpovědných) za zvýšenou ALP u tohoto pacienta. Za tímto účelem byla provedena chemiluminiscenční imunoanalýza specifické kostní ALP (Beckman Access Ostase). Výsledek tohoto testu byl 68,5 μg/l (referenční interval: 0,0-20,1 μg/l), což představuje významné zvýšení kostní ALP. K prozkoumání možného příspěvku dalších izoenzymů ALP byla v referenční laboratoři předem provedena elektroforéza. Tato metoda využívá elektroforézu k oddělení izoenzymů ALP a následnou denzitometrii ke kvantifikaci. Podobně jako u výsledků získaných v MSKCC byla celková hladina ALP u pacienta zvýšena na 524 U/l (referenční interval: 45-115 U/l). Zajímavé je, že hladina ALP v kostech byla abnormálně nízká a činila 7,8 % (referenční interval: 19,1-67,7 %) celkové hladiny ALP, zatímco hladina ALP v játrech byla zvýšená a tvořila 92,2 % celkové hladiny ALP. Placentární ani střevní izoenzymy nebyly zjištěny. Vzhledem k těmto výsledkům zahájil tým klinické péče vyšetřování možných hepatobiliárních stavů, zatímco laboratoř dále zkoumala rozporuplné výsledky.

V referenční laboratoři byla provedena alternativní metoda využívající kombinaci enzymové aktivity a tepelné inaktivace. Výsledky tohoto testu byly rovněž zvýšené jak pro jaterní (359 U/l; referenční interval: 0-94 U/l), tak pro kostní (101 U/l; referenční interval: 0-55 U/l) izoenzymy. Byla provedena zobrazovací vyšetření, která odhalila přítomnost kongestivní hepatopatie v důsledku poruchy perfuze sekundárně způsobené kongescí jaterních žil. Tento stav se obvykle projevuje zvýšenými hladinami ALP a GGT při normálních hladinách AST a ALT. Magnetická rezonance potvrdila progresi onemocnění v pravé pažní kosti a nové metastatické léze v těle lopatky. Zobrazovací vyšetření potvrdila přítomnost jaterní dysfunkce a progredujícího kostního onemocnění, což obojí může mít za následek zvýšené hladiny ALP v játrech a kostech. Kvůli těmto komplikacím byl pacient z klinického hodnocení vyloučen.

Diskuse

ALP je hydrolázový enzym zodpovědný za defosforylaci mnoha typů molekul, včetně proteinů a nukleotidů. Existují 4 základní izoenzymy ALP, včetně kostního, jaterního, střevního a placentárního. Přibližně 95 % celkové aktivity ALP v lidském séru pochází z kostních a jaterních zdrojů, které se u zdravých dospělých vyskytují v poměru přibližně 1:1 (1). U dospělých lze zvýšení ALP pozorovat u řady stavů, včetně těhotenství, městnavého srdečního selhání, ulcerózní kolitidy a bakteriálních infekcí. Zvýšená hladina ALP v játrech je nejčastěji pozorována u hepatobiliárních stavů, zejména u cholestázy, zatímco se zvýšením hladiny ALP v kostech se setkáváme u patologických stavů se zvýšenou aktivitou osteoblastů, jako je Pagetova choroba nebo některé druhy rakoviny, které buď vycházejí z kostí, nebo se do kostí rozšířily (2). Protože ALP může pocházet z několika zdrojů a může být zvýšena v důsledku různých stavů, je často nutné k určení původu vyšetřit izoenzymy ALP.

Existují 3 základní metody hodnocení izoenzymů ALP. Elektroforéza je 1 metoda, při níž se izoenzymy ALP oddělují na základě rozdílů v náboji. Protože je však pohyblivost jaterních a kostních izoenzymů prakticky rovnocenná, je nutný další krok. K využití rozdílů v sialaci mezi jaterními a kostními izoenzymy se přidává lektin z pšeničných klíčků (aglutin z pšeničných klíčků: WGA). Kostní izoenzym je obvykle bohatý na kyselinu sialovou a v agarózovém gelu reaguje s WGA a vysráží se. Po separaci se izoenzymy odečtou na denzitometru pro kvantifikaci a vyjádří se v procentech celkové ALP (3). Druhá metoda využívá rozdílů v tepelné stabilitě izoenzymů. Při této metodě se celková aktivita ALP měří přímo ze vzorku a po zahřátí. Kostní ALP je tepelně labilní, a proto měření provedená po zahřátí nebudou obsahovat aktivitu kostní ALP. Jaterní ALP je tepelně stabilní a bude aktivní při obou měřeních. Kostní ALP lze pak stanovit odečtením obou měření (4). Třetí metodou je imunoanalýza používaná výhradně ke kvantifikaci hladin kostní ALP (5). Existuje několik komerčně dostupných souprav pro imunoanalýzu kostní ALP, ačkoli v této studii byla použita metoda Beckman Access Ostase. Tato metoda je jednokrokový imunoenzymatický test. Stručně řečeno, myší monoklonální protilátka specifická pro kostní ALP se přidá k paramagnetickým částicím potaženým kozí polyklonální protilátkou proti myším. K potaženým částicím se poté přidá sérum pacienta a veškerá přítomná kostní ALP se naváže na monoklonální protilátku proti kostní ALP. Přidá se chemiluminiscenční substrát a světlo generované reakcí je přímo úměrné koncentraci kostní ALP ve vzorku.

V tomto případě se vzhledem k anamnéze Ewingova sarkomu a absenci příznaků nebo anamnézy jaterní dysfunkce nejprve vyšetřilo zvýšení hladiny kostní ALP. Kostní ALP byla zvýšená, avšak vzhledem k rozdílu v jednotkách mezi imunoanalýzou kostní ALP a enzymatickou analýzou celkové ALP (imunoanalýza měří množství v mikrogramech na litr oproti enzymatické analýze měřící aktivitu v jednotkách na litr) nelze výsledky používat zaměnitelně a je třeba je vhodně interpretovat. Pozorované zvýšení kostní ALP poskytlo důkaz, že zvýšení celkové ALP bylo alespoň částečně kostního původu, ale nebylo možné definitivně určit kostní ALP jako jediného přispěvatele. Následné testy využívající elektroforézu a tepelnou stabilitu k identifikaci zvýšení ostatních izoenzymů ALP sice odhalily zvýšení hladiny jaterní ALP, ale i ty prokázaly rozpor v hladině kostní ALP. Zobrazovací studie odhalily základní patologii pro zvýšené jaterní i kostní izoenzymy. Proto byl učiněn závěr, že nesouhlasné výsledky byly důsledkem snížené kostní ALP stanovené metodou elektroforézy.

Schopnost elektroforetické metody odlišit kostní ALP od jaterní ALP je založena na předpokladu, že kostní ALP přítomná v séru je bohatá na kyselinu sialovou. V séru existují 3 primární izoformy kostní ALP, a to B1, B2 a B/I (6). Zajímavé je, že bylo prokázáno, že se tyto izoformy liší počtem přítomných zbytků kyseliny sialové. Předchozí studie odhadla počet zbytků kyseliny sialové na 29 a 45 pro každý homodimer B1 a B2. B/I se skládá ze 70 % z kostního a 30 % ze střevního izoenzymu a má velmi málo zbytků kyseliny sialové (7). Různé izoformy se v přítomnosti WGA srážejí v různé míře v závislosti na počtu přítomných zbytků kyseliny sialové, přičemž B2 vykazuje nejvyšší míru precipitace, následován B1 a B/I. Podobně studie Farleyho a spol. prokázala, že tepelná inaktivace a imunoanalýza jsou lepší než precipitační test WGA pro detekci kostní ALP v séru postmenopauzálních osteoporotiků (8). Je pravděpodobné, že izoforma přítomná u tohoto pacienta měla méně zbytků kyseliny sialové, což by mohlo vysvětlit odchylný normální výsledek kostní ALP při použití elektroforetické metody. Je zajímavé, že 3 izoformy ALP vykazovaly podobnou kinetiku tepelné inaktivace (7).

V tomto případě byly k určení zdroje zvýšené ALP u pacienta s metastatickým kostním onemocněním a bez anamnézy jaterní dysfunkce použity 3 různé metody. Správná interpretace počátečního výsledku kostní ALP pomocí imunoanalýzy byla zásadní pro následnou diagnózu a léčbu dříve nediagnostikovaného onemocnění jater. Toto šetření poukazuje na důležitost pochopení specifických metodik a omezení různých testů ALP.

2 Nestandardní zkratky

• ALP

  alkalická fosfatáza

• AST

  .

  aspartátaminotransferáza

• ALT

  alanin-transamináza

• GGT

  γ-glutamyltransferáza

• WGA

  aglutin pšeničných klíčků.