Almindeligt anvendte apoptoseanalyser i apoptoseforskning
Spørgsmål:
Hvilke er de mest almindeligt anvendte apoptoseanalyser?
Proteinmanden siger:
Apoptoseforskning kræver brug af en bred vifte af apoptoseassays, da selve processen er ret kompliceret. Desuden er der ikke nogen enkelt parameter, der kan definere celledød i alle systemer, så du bør bruge flere tilgange i din forskning.
Hovedtyper af apoptoseassays
Der er fem forskellige typer af apoptoseassays, der i øjeblikket anvendes i apoptoseforskning. Dette omfatter caspaseassays, DNA-fragmenteringsassays, cellepermeabilitetsassays og mitokondrielle assays. Derudover er der også en type assay, der kan bruges til at lette analysen af apoptose-signalveje.
Caspase assays. Tilstedeværelsen af caspaseenzymer i en given prøve er en sikker indikator for, at der finder komplekse biokemiske hændelser sted, der er forbundet med apoptose. Som sådan kan caspaseassager anvendes til at påvise apoptose i cellepopulationer i de tidligste stadier. Disse assays anvender rutinemæssigt specifikke substrater, som fordøjes af caspaser for at frigive kolorimetriske eller fluorometriske substrater.
DNA-fragmenteringsassays. Apoptose og DNA-spaltning går hånd i hånd, så du kan bestemme omfanget af apoptose ved at måle de DNA-fragmenter, der er til stede i din prøve. De fleste forskere bruger apoptopisk DNA-ladderanalyse, ELISA-kvantificering og TUNEL-assays (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) til dette formål.
Cellepermeabilitetsassays. Apoptose i mellemstadiet kan bestemmes ved hjælp af cellepermeabilitetsassays. Som du sikkert ved, har sunde celler stive plasmamembraner, mens døde celler har meget permeable cellemembraner. Med deres meget kompromitterede membraner kan fluorescerende farvestoffer let passere gennem apoptopiske celler. Når dette sker, vil du observere et karakteristisk fluorescens- eller farvningsmønster, der indikerer tilstedeværelsen af apoptopiske cellepopulationer i din prøve.
Den øgede cellepermeabilitet resulterer også i tab af cytosolproteiner fra cellen. Laktatdehydrogenase (LDH) er et opløseligt cytosolisk enzym, der frigives i kulturmediet efter tab af membranintegritet som følge af enten apoptose eller nekrose. LDH-aktivitet kan derfor anvendes som en indikator for cellemembranintegritet og tjener som et generelt middel til at vurdere cytotoksicitet som følge af kemiske forbindelser eller miljømæssige toksiske faktorer. Der findes flere assays til kvantificering af frigivet LDH.
Mitokondrielle assays. Mitokondrielle assays kan hjælpe med at bestemme apoptose på et tidligt stadium, da der anvendes et kationisk farvestof, der afgiver en forskellig fluorescens, når det anvendes i sunde cellepopulationer og apoptopiske cellepopulationer.
Ved at vide, hvilke apoptoseassays der skal anvendes, og hvornår de skal anvendes, kan i høj grad hjælpe dig i din forskning, så du må hellere begynde at kende dem udenad.