De fem bedste metoder til primær mærkning af antistoffer

I enhver anvendelse, hvor der anvendes antistoffer til signaldetektion (f.eks. Western Blotting, ELISA, immunohistokemi eller FACS), er der to metoder til mærkning af antistoffer: direkte og indirekte mærkning. Standard Western Blotting anvender indirekte mærkning, fordi man bruger et primært antistof til at detektere målantigenet efterfulgt af et sekundært antistof, hvortil der er knyttet et detektionsmolekyle.

I nogle situationer kan det være bedre at springe det sekundære antistof og alle de tilhørende trin over og direkte mærke sit primære antistof. Tilfælde, der kræver direkte mærkning af det primære antistof, omfatter bl.a:

• Der er uspecifik binding af sekundært antistof
• Du bruger ikkestandardorganisme-primære antistoffer – i dette tilfælde kan det være vanskeligt at finde gode sekundære antistoffer
• Ved multiplexing med antistoffer, der stammer fra samme art
• Når du har brug for at forkorte forsøgstiden ved at eliminere inkubation af sekundære antistoffer og de tilhørende vasketrin

Antistofparametre

Du kan mærke dit valgte antistof ikke kun med fluorescerende farvestoffer, men også med fluorescerende proteiner, enzymer og farvede partikler. Alle disse er normalt knyttet via en terminal lysingruppe, så du skal undgå aminholdige buffere (f.eks. Tris) og molekyler gennem alle trin. Ellers vil du for det meste mærke dine buffermolekyler! Du bør også undgå det almindelige bufferkonserveringsmiddel natriumazid, da det vil forstyrre mærkningsreaktionen.

Antikroppen til mærkning bør være i en koncentration på mindst 0,5 mg/ml og >90% ren. Jo færre forstyrrende proteiner og molekyler, der indeholder aminogrupper, der er i antistofpræparatet, jo mere effektiv vil mærkningsreaktionen være. Men selv hvis dit antistof svømmer i glycin og BSA, kan du altid fjerne interfererende stoffer ved hjælp af dialyse. Du kan også forbedre renheden af dit antistof ved at lade det passere gennem en A-protein-kolonne, eller du kan endda forberede din egen affinitetsrensningskolonne med et egnet antigen.

Hovedsagelige interne metoder til mærkning af antistoffer

NHS (Succinimidyl) Ester-metode

Denne metode er nyttig til konjugering af antistoffer med almindeligt tilgængelige fluorescerende farvestoffer som f.eks. rhodamin-derivater. Den udføres typisk i en fosfatbuffer med efterfølgende separation på søjlen fra det umærkede farvestof. Den største ulempe er, at esterne er ustabile, fordi de er fugtfølsomme. Det mærkede antistof bør anvendes umiddelbart efter reaktionens afslutning.

Isothiocyanatmetoden

Du kan bruge denne metode til at fremstille fluoresceinisothiocyanat (FITC), som er meget populært ved fremstilling af fluorescerende proteiner og antistoffer. Hvis du har arbejdet med fluorescerende mikroskopi, har du beskæftiget dig med FITC. Isothiocyanat-analoger af forskellige standardfarvestoffer er også tilgængelige.

Isothiocyanat er mere stabilt end NHS, men det er sværere at fremstille, og din mærkningsreaktion vil sandsynligvis være mindre effektiv med denne metode. Som med NHS skal det overskydende farvestof fjernes efter reaktionen ved kromatografi.

Carbodiimidmetoden

Carbodiimidafledte forbindelser omdanner carboxylgrupper på proteiner til reaktive mellemprodukter, som kan reagere med lysiner. Carbodiimidernes høje reaktivitet betyder, at de kan anvendes til mærkning af antistoffer med relativt inaktive materialer som f.eks. magnetiske partikler eller guldpartikler. Det mest almindeligt anvendte carbodiimid er EDC. NHS tilsættes undertiden til reaktionen for at fremme dannelsen af relativt stabile mellemprodukter.

Metoden er enkel, men i lighed med NHS er EDS hygroskopisk, så du skal bruge dit antistof umiddelbart efter mærkning.

Two-Tag-metode

Her mærker du dit antistof med et andet protein, der fungerer som katalysator, f.eks. HRP eller alkalisk fosfatase. Da begge molekyler indeholder mange aminogrupper, vil en direkte krydsbinding (som ved NHS-metoden) føre til polymerer af det samme molekyle. Derfor vil man udføre sammenkædningen i to separate trin. Du krydsforbinder antistoffet til molekyle X og katalysatoren til molekyle Y. Du skal vælge X og Y omhyggeligt, fordi de skal interagere for at danne konjugatet. Man kunne f.eks. vælge maleimid som X og et thiol som Y.

Mens det resulterende konjugat vil være mere stabilt end det, man opnår med NHS-metoden, vil denne metode kræve tre gange så meget arbejde; separate mærkning og rensningstrin for antistoffet, katalysatoren og konjugeringsreaktionen. Den gode nyhed er, at du kan købe et præ-mærket katalytisk molekyle og derefter mærke dit antistof i overensstemmelse hermed.

Periodatmetoden

Denne metode er nyttig til generering af specifikke HRP-antistofkonjugater. Periodat aktiverer HRP ved at skabe aldehydmolekyler, der interagerer med lysinrester. HRP selv har kun få lysinrester, så enzympolymerisation er ikke et væsentligt problem. Bindingerne mellem HRP og antistoffet er reversible, medmindre de stabiliseres ved at tilsætte natriumcyanhydrid.

Det var min gennemgang af de bedste hjemmelavede antistofmærkningsmetoder. Der findes en masse kommercielle kits på markedet med lignende underliggende kemi, som kan gøre dit liv meget lettere. Hvis dit laboratorium har pengene.

Har du en anden metode til mærkning af antistoffer, som du gerne vil dele med os? Kom i kontakt ved at skrive i kommentarfeltet.

Litteratur:

Meyer JP, Adumeau P, Lewis JS, Lewis JS, Zeglis BM. Click Chemistry and Radiochemistry: De første 10 år. Bioconjug Chem. (2016) 27(12):2791-2807. doi: 10.1021/acs.bioconjchem.6b00561. Epub 2016 Nov 22.