Proximity-Labeling MS (APEX-MS)

Til denne metode er proteinet af interesse fused til en peroxidase (ascorbinsyreperoxidase; APEX). Ved behandling med H2O2 omdanner APEX exogent tilført biotin-phenol til biotin-phenoxylradikaler, hvilket resulterer i en kovalent mærkning af protein i en radius på 20 nm. Efterfølgende beriges de biotinylerede proteiner ved hjælp af Steptavidin. Denne teknologi gør det for første gang muligt at tage “øjebliksbilleder” af lokale proteinmiljøer på et givet tidspunkt og at opfange forbigående proteininteraktioner. Nærhedsbaserede mærkningsmetoder har gjort hurtige fremskridt i de sidste mange år og har vist sig at give supplerende resultater i forhold til traditionelle affinitetsbaserede oprensningsmetoder (AP-MS) og har således potentiale til at åbne helt nye forskningsveje og give ny indsigt i proteinfunktioner.

APEX er blevet anvendt til at indfange hele organelle proteomer med høj tidsmæssig opløsning, men dens bredde af mærkning anses generelt for at udelukke den højere rumlige opløsning, der er nødvendig for at udspørge specifikke proteinnetværk. Vi har for nylig fundet en løsning på dette problem ved at kombinere kvantitativ proteomik med et system af rumlige referencer. Denne nye metode giver os mulighed for at opløse kendte bindingspartnere såvel som tidligere uidentificerede netværkskomponenter, som for nylig vist i en proof of principle-undersøgelse, der afhører proteiner, der er engageret af G-protein-koblede receptorer, mens de dynamisk signalerer og trafikerer som reaktion på ligand-induceret aktivering.