Specifikke antistoffer har brug for specifik validering

Et af de mest anvendte værktøjer inden for biomedicinsk forskning er det monoklonale antistof. Disse proteiner har potentiale til at opsøge og binde sig til ethvert ønsket mål og kan bruges til celleafbildning, cellesortering, immunoassays og mange andre anvendelser.

Men disse arbejdsheste i laboratoriet kører ikke altid som de skal. Afhængigt af arten af dets mål kan et antistof være inkonsekvent i visse tests – f.eks. kan det binde til det forkerte mål og give falsk positive resultater. I betragtning af den udbredte brug af antistoffer til forskning er dette potentielt et milliardproblem.

Et vigtigt mål er at udvikle strategier til validering af antistoffer, så forskerne kan have tillid til, at et antistof er egnet til deres særlige behov – og at deres resultater vil være reproducerbare.

Thermo Fisher Scientific har udviklet en todelt antistofvalideringsplatform til at teste ikke kun specificiteten af sine InvitrogenTM -antistoffer (at de binder til det rigtige mål), men også deres egnethed til forskellige anvendelser. Den samme test er dog ikke egnet til alle antistoffer: Thermo Fisher anvender en passende test for hvert proteinmål, afhængigt af dets biologiske funktion. Visse antistoffer testes bedst ved hjælp af CRISPR-Cas9 for at slå det gen ud, der koder for målproteinet, og kontrollere, at antistoffet ikke længere binder til noget som helst. Andre antistoffer kan testes ved hjælp af immunoprecipitation efterfulgt af massespektrometri for at kontrollere, at de er bundet til de rigtige mål.

Thermo Fisher er ved at udvikle og forfine antistofvalideringstests baseret på målantigenets biologiske funktion. Her er to casestudier af specifikke proteiner og deres specificitetstest.

Knock-outs for kræft

Den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR) er et velundersøgt protein: dysregulering i EGFR-systemet er impliceret i forskellige kræftformer. For at teste, om antistoffer er specifikke for EGFR eller for et af dets nedstrømsmål, kan forskerne slå kritiske proteiner i EGFR-banen ud og se, hvordan det antistofbindende signal ændres.

I de seneste år er CRISPR-Cas9-systemet blevet kendt som den mest pålidelige og kraftfulde måde at slå et gen ud på. Det gør det ideelt til at teste antistofspecificitet inden for en signalkaskade. Thermo Fisher-forskerne tog en standard human karcinomlinje (A-431) og brugte en western blot til at få en basislinje for bindingssignalet. Derefter brugte de CRISPR-Cas9 til at fjerne målgenet og skabe EGFR-knockouts. Et western blot af protein ekstraheret fra disse knockout-celler viste, at der ikke længere var noget signal for et målprotein (figur 1).

Der blev foretaget yderligere test, som bekræftede resultatet. Signaleringskaskaden nedstrøms EGFR omfatter proteiner som RAS, RAF, MEK og ERK. Aktivering af EGFR ved hjælp af epidermal vækstfaktor (EGF) fører til fosforylering af disse nedstrømsproteiner, som kan påvises ved hjælp af andre antistoffer, der genkender disse fosforylerede tilstande. Tilsætning af EGF til EGFR-knockoutcellerne bør imidlertid ikke resultere i nogen nedstrømsfosforylering. Tilsætning af de samme antistoffer, der genkender fosforylerede mål, gav ingen signaler. Thermo Fisher-forskerne er således sikre på, at anti-EGFR-antistoffet er målspecifikt.

En række modifikationer

I cellekernen er DNA pakket tæt ind – viklet omkring histonproteiner for at danne kromatin. Det er vanskeligt at studere histoner, da de kan påvirkes af en række kemiske ændringer, såkaldte posttranslationelle modifikationer (PTM’er). For eksempel kan rester på et histon få en eller flere methyl-, acetyl- eller fosforylgrupper, som hver især har en virkning på den cellulære funktion.

Visse teknikker, såsom chromatinimmunopræcipitation (ChIP), western blotting, immunofluorescens og immunohistokemi, anvender antistoffer mod specifikke histon-PTM’er til at forstå histonets tilstand og dets binding. Flere histonmodifikationer har imidlertid lignende DNA-bindingsmønstre; et antistof, der ikke er blevet strengt testet mod alle histon-PTM’er, kan binde til den forkerte type og give et falsk-positivt resultat.

Thermo Fisher testede sine histon-PTM-specifikke antistoffer ved hjælp af en række peptider med en række forskellige PTM’er. Hvis et antistof virkelig er specifikt for en PTM, vil det kun binde til de pletter, der bærer denne PTM. Thermo Fisher-forskerne målte signalerne ved hjælp af en specificitetsfaktor: den gennemsnitlige intensitet af alle pletter, der indeholder en bestemt PTM, divideret med den gennemsnitlige intensitet af alle pletter uden PTM (figur 2). Antistofferne viste en 4- til 190 gange højere specificitetsfaktor for deres PTM-måltilstand end for ikke-måltilstande, hvilket giver tillid til, at de er meget selektive.

Thermo Fisher har syv andre specificitetstest ud over genetisk knock out og peptidarray’er. Disse omfatter anvendelse af RNAi til at slå ned på genekspression, et differentielt opløftet antistof til uafhængigt at verificere målretning og naturligt forekommende variabel ekspression til at bekræfte specificitet. Kun ved hjælp af sådanne omhyggelige og strenge test kan forskerne være sikre på, at deres arbejdsredskaber i laboratoriet er egnet til formålet – og at deres arbejde vil kunne holde til den mest grundige undersøgelse.

Find anvendelsesnoter om disse Invitrogen-antistoffer og mere om Thermo Fisher Scientifics todelte testmetode her.