ABTS
17.4 Fenolit
Klassisen Lac-substraatin ABTS:n hapettaminen Tetracystis aeria -levän lakkaasilla on laajalle levinnyt klorofyysilevissä. Esimerkiksi Moewusinia-lajit, mukaan lukien Chlamydomonas moewusii ja T. aeria, erittävät oletettuja ”oikeita” lakkeja. Nämä entsyymit hapettavat fenolisia substraatteja optimaalisesti neutraalissa tai emäksisessä pH:ssa. Tetracystis-laccaasi muuntaa tehokkaasti muita yhdisteitä, kuten bisfenoli A:ta, 17α-etyyliestradiolia, nonyylifenolia ja triklosaania ABTS:n läsnä ollessa redox-välittäjänä, kun taas antraseeni, veratryylialkoholi ja adleroli pysyvät muuttumattomina. Entsyymien mahdolliset luonnolliset toiminnot, kuten monimutkaisten polymeerien synteesi tai detoksifikaatioprosessit, voivat auttaa levien selviytymistä epäsuotuisissa ympäristöissä. Saastuneissa pintavesissä Lac-entsyymiä tuottavat viherlevät saattavat edistää fenolisten epäpuhtauksien hajottamista ympäristössä.
Putatiivinen Lac (CotA) Bacillus pumilus MK001:stä, joka on kloonattu ja ekspressoitu E. coli-organismin tuottama CATA on termostabiili ja sen puoliintumisaika on 60 minuuttia 80 °C:ssa, ja sillä on potentiaalinen sitoutumisaffiniteetti ferulihappoon, kahvihappoon ja vanilliiniin .
Fenolit ovat tunnettuja inhibiittoreita sellulaasille ja fermentoiville mikro-organismeille biojalostusprosesseissa. Lacin lisääminen poistaa fenoliyhdisteet ja lyhentää sen jälkeen fermentatiivisen mikro-organismin lag-vaihetta. Lacin käyttö vähentää kuitenkin glukoosin vapautumista entsymaattisen hydrolyysin aikana. Ligniinin osuus ja fenolien koostumus ovat keskeisiä tekijöitä sellulaasin inhiboinnissa, kun entsymaattinen hydrolyysi yhdistetään Lacin detoksifikaatioon .
Ympäristöbioteknologian yksi mielenkiintoinen sovellus on Lacin immobilisointi fenolisten epäpuhtauksien poistamiseksi hapettamalla. Höyrystetyillä piidioksidi-nanohiukkasilla on mielenkiintoinen potentiaali tukimateriaalina Lacin immobilisoinnissa sorptio-avusteisen immobilisoinnin avulla sellaisten sovellusten näkökulmasta, kuten mikrosaasteiden poistaminen vesifaaseissa. Leviathan-suvun, Coriolopsis polygonal-, Cerrena unicolor-, P. ostreatus- ja T. versicolor-suvun Lacin immobilisointi höyrystetyille piidioksidi-nanohiukkasille erikseen tai yhdistelmänä tuottaa lisääntynyttä aktiivisuutta pH-alueella 3-7. Eri laakit eroavat toisistaan pH-optimaaleiltaan ja substraattiaffiniteetiltaan. Niiden erojen hyödyntäminen mahdollisti räätälöidyn nanobiokatalyytin valmistamisen, joka pystyy hapettamaan laajemman substraattivalikoiman kuin liuotetut tai erikseen immobilisoidut entsyymit. Nanobiokatalysaattorilla on potentiaalia biokemialliseen hapetukseen useiden kohdesaasteiden eliminoinnissa. On vahvistettu, että Lac-immobilisoinnilla piidioksidi-nanopartikkeleihin saaduilla ei-vokaalisilla nanobiokatalyytteillä oli laaja substraattispektri, joka koski vaikeasti hajoavien epäpuhtauksien, kuten fenolisten EDC-yhdisteiden (bisfenoli A), hajoamista .Tämä korostaa huurtuneen piidioksidin nanohiukkasten ja Lac-komposiittien potentiaalia kehittyneessä biologisessa jätevedenkäsittelyssä.
Lacsit pystyvät katalysoimaan fenolisten yhdisteiden yhden elektronin hapettumista radikaaleiksi välituotteiksi, jotka voivat sen jälkeen kytkeytyä toisiinsa kovalenttisten sidosten kautta. Näillä reaktioilla uskotaan olevan tärkeä rooli humifikaatioprosessissa ja fenolisia funktionaalisuuksia sisältävien epäpuhtauksien muuntumisessa ympäristössä. Reaktiomalli kehitettiin integroimalla metalli-HA:n sitoutumistasapainot ja kineettiset yhtälöt, joilla ennustettiin triklosaanin muuntumisnopeus HA:n ja kahdenarvoisten metalli-ionien, kuten Ca2+, Mg2+, Cd2+, Co2+, Mn2+, Ba2+ ja Zn2+, läsnä ollessa.
Hydroksyloituja polybromattuja difenyylieettereitä (OH-PBDE-yhdisteet) on löydetty usein meribiosfääristä ilmaantuvina orgaanisina epäpuhtauksina. OH-PBDE-yhdisteiden tuotanto on todennäköisesti seurausta 2,4-DBP:n tai 2,4,6-TBP:n Lac-katalysoidusta hapettumisesta syntyvien bromifenoksiradikaalien kytkeytymisestä. Lacin suorittama bromifenolien muunnos on pH-riippuvainen, ja siihen vaikuttaa myös entsyymiaktiivisuus. Kun otetaan huomioon 2,4-DBP:n ja 2,4,6-TBP:n runsaus ja Lacin fylogeneettinen jakautuminen ympäristössä, bromifenolien Lac-katalyyttinen muuntuminen voi olla tärkeä reitti OH-PBDE-yhdisteiden luonnollisessa biosynteesissä.
Phanerochaete chrysosporium kuuluu ryhmään ligniiniä hajottavia sieniä, jotka erittävät erilaisia oksidoreduktiivisia entsyymejä, kuten ligniiniperoksidaasia (LiP) ja mangaaniperoksidaasia (MnP). Lacien tuotantoa tässä sienessä ei kuitenkaan ole täysin osoitettu ja se on edelleen kiistanalainen. T. versicolorista peräisin olevan LacIIIb-geenin ja Pleurotus eryngii -sienestä peräisin olevan vpl2-geenin sekä endogeenisten geenien mnp1 ja lipH8 yhteisekspressio paransi peroksidaasien ja laccaasien yhteisekspressiota jopa viisinkertaiseksi villityyppisiin lajeihin verrattuna. Transformanttien kannoilla on laaja spektri fenolisten / ei-fenolisten biotransformaatiossa ja suuri prosenttiosuus synteettisten väriaineiden värinpoistossa verrattuna vanhempien kantaan, ja ne ovat helppoja ja tehokkaita Lacsin ja peroksidaasien yhteisekspressiota sopivissa basidiomykeettilajeissa .
Viime aikoina Lacia on sovellettu nanobioteknologiaan, joka on kasvava tutkimusalue, ja se katalysoi elektroninsiirtoreaktioita ilman ylimääräisiä kofaktoreita .
Hiilinanopartikkelit ovat lupaavia ehdokkaita entsyymien immobilisointiin. Verrattuna vapaaseen Laciin immobilisoitujen entsyymien reaktionopeudet ovat huomattavasti pienemmät. Hiilinanopartikkelien aggregaation aiheuttamaa diffuusiorajoitusta ei voida jättää huomiotta, koska se voi johtaa reaktioaikojen pidentymiseen, heikkoon tehokkuuteen ja korkeisiin taloudellisiin kustannuksiin. Lisäksi tämä ongelma pahenee, kun ympäristössä on pieniä pitoisuuksia epäpuhtauksia.
Bisfenoli A (BPA) on hormonitoimintaa häiritsevä kemikaali, jota esiintyy kaikkialla ympäristössä sen laajan teollisen käytön vuoksi. Maailman laajimmin viljellyn sienen (eli valkomätäsienen, P. ostreatus) ekstrasellulaarinen Lac hajotti tehokkaasti BPA:ta. BPA:lle altistumisella ei ole haitallisia vaikutuksia tälle syötävälle sienelle .
BPA:n poistaminen Lacin avulla jatkuvassa entsymaattisessa kalvoreaktorissa, jota arvioitiin synteettisissä ja todellisissa biologisesti käsitellyissä jätevesissä sekoitussäiliöreaktoriin ja keraamiseen kalvoon yhdistetyssä reaktorikokoonpanossa, osoitti BPA:n poistuvan lähes kokonaan. Polymerisaatio ja hajoaminen ovat todennäköisiä mekanismeja BPA:n muuntamisessa Lacin avulla.
Basidiomycota-suvun organismeilla on valtava bioremediaatiopotentiaali fenolisten oksidaasiensa ansiosta fenolien hajottamisessa. Lac ja tyrosinaasi ovat pääasiassa T. versicolorissa ja Agaricus bisporusissa. Uusia lupaavia villityyppisiä entsyymien tuottajia on ilmaantunut, ja lisäksi on rakennettu useita rekombinantteja kantoja, jotka perustuvat pääasiassa hiivoihin tai Aspergillus-kantoihin isäntinä. Konstruktiot mahdollistavat sovellukset fenolien, polyfenolien, kresolien, alkyylifenolien, naftolien, bisfenolien ja halogenoitujen (bis)fenolien hajottamiseen. Biologisia ja fysikaalis-kemiallisia menetelmiä voitaisiin yhdistää, jotta prosessit soveltuisivat teolliseen käyttöön.
Kasviperoksidaaseilla on suuri potentiaalinen hyöty fenoleilla saastuneen jäteveden puhdistamisessa. Näiden entsyymien laajamittainen käyttö fenolipuhdistuksessa edellyttää halpaa, runsasta ja helposti saatavilla olevaa peroksidaasia sisältävää materiaalia. Tärkkelysteollisuuden jätetuotteena syntyvä perunamassa sisältää suuria määriä aktiivisia peroksidaaseja, ja perunamassan entsyymit säilyttävät aktiivisuutensa pH:ssa 4-8 ja ovat vakaita laajalla lämpötila-alueella. Perunamassan fenolin poistotehokkuus on yli 95 % .
Nanohuokoisille piihelmille immobilisoitu Lac hajottaa yli 90 % 2,4-dinitrofenolista lyhyessä ajassa (12 tuntia). Immobilisointiprosessi parantaa Lacin aktiivisuutta ja kestävyyttä saastuttavan aineen hajottamisessa. Yli 50 °C:n lämpötilat vähentävät entsyymiaktiivisuutta noin 60 %:iin. pH ja välittäjäainepitoisuus eivät kuitenkaan voineet vaikuttaa entsyymiaktiivisuuteen. Hajoamisen kinetiikka on Michaelis-Mentenin yhtälön mukainen .
Ruohon (Lolium perenne) vesipitoiset eksudaatit voivat hajottaa BPA:ta sekä luonnollisen orgaanisen aineen (NOM) puuttuessa että läsnä ollessa. Eksudaateissa, joihin on lisätty NOM:ää, hajoamisprosessi on pidempi kuin ilman NOM:ää. Peroksidaasi- ja Lac-aktiivisuus eksudaateissa viittasi näiden entsyymien merkittävään osallistumiseen BPA:n hajoamiseen.
Organofluoriyhdisteistä on tullut tärkeitä rakennusaineita monenlaisille kehittyneille materiaaleille, polymeereille, agrokemikaaleille ja lääkkeille. Konsepti trifluorimetyyliryhmän tuomisesta suojaamattomiin fenoleihin käyttämällä biokatalyyttiä (Lac), tBuOOH:ta ja joko Langlois’n reagenssia tai Baran’n sinkkisulfinaattia saavutettiin. Menetelmä perustuu kahden radikaalilajin, nimittäin suoraan Lacin tuottaman fenoliradikaalikationin ja CF3-radikaalin rekombinaatioon. Lac-katalysoitu trifluorimetylaatio etenee miedoissa olosuhteissa ja hajottaa trifluorimetyylisubstituoituja fenoleita, joita ei ollut saatavilla klassisilla menetelmillä.
Lacia tuottavalla makean veden ascomycete Phoma sp. kanta UHH 5-1-03:lla on potentiaalia käytännön mikrosaasteiden poistoon. Bisfenoli A (BPA), karbamatsepiini (CBZ), 17α-etinyyliestradioli (EE2), diklofenaakki (DF), sulfametoksatsoli (SMX), tekninen nonyylifenoli (t-NP) ja triklosaani (TCS) ovat substraatteja paremmuusjärjestyksessä: EE2≫BPA>TCS>t-NP>DF>SMX>CBZ. Saadut aineenvaihduntatuotteet viittaavat hydroksylaatio-, syklisaatio- ja dekarboksylaatioreaktioihin sekä Lac-reaktioille tyypilliseen oksidatiiviseen kytkeytymiseen. Havainnot viittaavat vahvasti siihen, että Phoma sp.:n solunulkoinen Lac osallistuu suurelta osin sienien biotransformaatioon.
Nanobiokatalyysiin on kiinnitetty entistä enemmän huomiota. Cu(II)- ja Mn(II)-chelatoituihin magneettisiin mikropalloihin palautuvasti immobilisoitu Lac onnistui poistamaan BPA:ta vedestä. Vapaaseen Laciin verrattuna immobilisoidun Lacin lämpö- ja varastointistabiilisuus paranevat merkittävästi. Yli 85 % BPA:sta poistettiin optimaalisissa olosuhteissa .
Liuoksessa olevien entsyymien käyttämiseen vedenkäsittelyssä liittyy kuitenkin rajoituksia, joita ovat uudelleenkäytön estäminen, entsyymien lyhyt käyttöikä ja korkeat kertakäyttökustannukset. Chen et al. kehittivät uudenlaisen biokatalyytin immobilisoimalla sieni Lacin hiivasolujen pinnalle synteettisen biologian tekniikoita käyttäen. Biokatalyyttiä kutsutaan nimellä surface display Lac (SDL), ja sitä voidaan käyttää uudelleen erittäin vakaasti, sillä se säilytti 74 prosenttia alkuperäisestä aktiivisuudestaan kahdeksan toistetun eräreaktion jälkeen. SDL:n tehokkuus ja konseptin toimivuus huolta aiheuttavien epäpuhtauksien käsittelyssä osoitettiin bisfenoli A:lla ja sulfametoksatsolilla.