Ammoniumsulfaattiproteiinien saostaminen:

Suolan saostus voi olla erittäin tehokas väline proteiinien puhdistamiseen saostamalla. Ammoniumsulfaatti on yleensä valittu suola, koska se on halpa, liukenee hyvin veteen ja pystyy muuttumaan paljon hydratoituneemmaksi (vuorovaikuttaa useamman vesimolekyylin kanssa) kuin lähes mikään muu ioniliuotin. Käytännössä ammoniumsulfaatti lisätään joko suoraan kiinteänä aineena tai (yleensä) kylläisenä liuoksena haluttujen proteiinien saostamiseksi.

Matalilla suolapitoisuuksilla (<0,15M) suolan lisääminen yleensä lisää proteiinien liukoisuutta, koska ionit suojaavat proteiinimolekyylejä toisten molekyylien varauksilta; tätä suuntausta kutsutaan ”suolaamiseksi”. Jossain vaiheessa ionivahvuus nousee liian suureksi ja alkaa vaikuttaa negatiivisesti proteiinien liukoisuuteen, mitä kutsutaan ”suolan poistamiseksi”. Tämä johtuu siitä, että liuennut suola kilpailee proteiinien kanssa niukoista vesimolekyyleistä, mikä lisää veden pintajännitystä ja saa proteiinin taittumaan tiukemmin. Proteiinien pinta-alan pieneneminen tarkoittaa, että proteiinien ja veden väliset vuorovaikutukset vähenevät, jolloin proteiinimolekyylien väliset hydrofobiset vuorovaikutukset lisääntyvät, mikä aiheuttaa aggregaatiota ja sittemmin saostumista.

Liuoksessa olevia proteiineja voidaan myös fraktioida, koska ne saostuvat suolapitoisuuden funktiona. Tällä tavoin on mahdollista puhdistaa tiettyjä proteiineja lisäämällä tietty määrä ammoniumsulfaattia ei-toivottujen proteiinien saostamiseksi, talteenottamalla supernatantti ja lisäämällä sitten hieman enemmän ammoniumsulfaattia halutun proteiinin saostamiseksi ja tallentamalla sitten tämä saostetun proteiinin pelletti. Koska suolan saostus vaikuttaa vain proteiinien liukoisuuteen eikä denaturoi niitä, talteenotettu fraktio voidaan säilyttää suolaliuoksessa pitkiä aikoja ilman, että tarvitsee huolehtia bakteerikontaminaatiosta, koska korkea suolapitoisuus estää mikrobien kasvun tai proteaasiaktiivisuuden.

Koska ammoniumsulfaattisaostus ainoastaan vähentää proteiinien liukoisuutta eikä denaturoi niitä, proteiinit voidaan konsentroida poistamalla jäljelle jäänyt ammoniumsulfaattiliuos, minkä jälkeen proteiinipelletti voidaan resolubilisoida tavanomaisissa puskureissa tai pienemmällä ammoniumsulfaattipitoisuudella. Proteiiniliuoksen jatkopuhdistamiseen voidaan sitten käyttää hydrofobista vuorovaikutuskromatografiaa tai geelisuodatuskromatografiaa. Ammoniumsulfaattia voidaan käyttää myös joidenkin denaturointiaineiden, kuten urean, taittamien proteiinien ohjaamiseen takaisin oikeaan natiiviin konformaatioonsa lisäämällä asteittain ammoniumsulfaatin konsentraatiota.

On joitakin parhaita käytäntöjä, jotka on otettava huomioon ammoniumsulfaatin kanssa työskenneltäessä, kuten:

• Käytä huhmareja ja morttelia murskataaksesi kokkareet ja muulla tavoin murskataaksesi ammoniumsulfaatin lisäämisen ja liuottamisen helpottamiseksi.
• Lisää vain pieni määrä ammoniumsulfaattia kerrallaan, odota, että se liukenee, ja sekoita varovasti vaahtoamisen välttämiseksi.
• Käytä puskuria, kuten 50 mM HEPES:iä tai Tris:iä ammoniumsulfaatin happamoittavan luonteen minimoimiseksi.
• Käytä analyyttistä ammoniumsulfaattilaatua, sillä alempilaatuiset ammoniumsulfaattilaadut ovat tyypillisesti raskasmetallikontaminaatioita.

Suolan saostamisprosessiin liittyy joitakin haittoja. Proteiinien suolaaminen vaatii ennakkotietoa proteiinin liukoisuudesta. Lisäksi alkuperäisessä näytteessä mahdollisesti olevat epäpuhtaudet voivat edelleen olla kiinnostavaa proteiinia sisältävässä fraktiossa; tämä prosessi konsentroi proteiinin, mutta ei puhdista sitä. Lisäksi voi olla tarpeen poistaa suola proteiininäytteestä, joten tarvitaan jatkokäsittelyä joko dialyysin tai kromatografian muodossa.

Seuraavat blogikirjoitukset

• Mitä proteiinien saostustekniikoita käytetään konsentrointiin ja puhdistukseen?
• Kasviproteiinien uuttaminen ja proteiinien saostustekniikat