Erityiset vasta-aineet tarvitsevat erityistä validointia

Monoklonaalinen vasta-aine on yksi biolääketieteellisessä tutkimuksessa yleisimmin hyödynnetyistä työkaluista. Nämä proteiinit pystyvät etsimään minkä tahansa halutun kohteen ja sitoutumaan siihen, ja niitä voidaan käyttää solujen kuvantamiseen, solujen lajitteluun, immunomäärityksiin ja moniin muihin sovelluksiin.

Mutta nämä laboratorion työhevoset eivät aina toimi oikein. Kohteen luonteesta riippuen vasta-aine saattaa olla epäjohdonmukainen tietyissä testeissä – se voi sitoutua väärään kohteeseen ja antaa esimerkiksi vääriä positiivisia tuloksia. Kun otetaan huomioon vasta-aineiden käytön yleisyys tutkimuksessa, tämä on potentiaalisesti miljardien dollarien ongelma.

Päätavoitteena on kehittää vasta-aineiden validointistrategioita, jotta tutkijat voivat luottaa siihen, että vasta-aine soveltuu heidän erityistarpeisiinsa – ja että tulokset ovat toistettavissa.

Thermo Fisher Scientific on kehittänyt kaksiosaisen vasta-aineiden validointialustan, jonka avulla voidaan testata InvitrogenTM -vasta-aineiden spesifisyyden testauksen (eli sen, että vasta-aineet sitoutuvat oikeaan kohdekohteeseen) lisäksi myös vasta-aineiden soveltuvuutta erilaisiin sovelluksiin. Sama testi ei kuitenkaan sovellu kaikille vasta-aineille: Thermo Fisher käyttää kullekin proteiinikohteelle sopivaa testiä sen biologisesta tehtävästä riippuen. Tietyt vasta-aineet on parasta testata käyttämällä CRISPR-Cas9-menetelmää, jolla poistetaan kohdeproteiinia koodaava geeni ja tarkistetaan, että vasta-aine ei enää sitoudu mihinkään. Toiset vasta-aineet voidaan testata käyttämällä immunoprecipitaatiota ja sen jälkeen massaspektrometriaa sen tarkistamiseksi, että ne ovat sitoutuneet oikeisiin kohteisiin.

Thermo Fisher kehittää ja tarkentaa vasta-aineiden validointitestejä kohdeantigeenin biologisen toiminnan perusteella. Seuraavassa on kaksi tapaustutkimusta spesifisistä proteiineista ja niiden spesifisyystesteistä.

Syöpäsolut

Epidermisen kasvutekijän reseptori (EGFR, epidermal growth factor receptor) on hyvin tutkittu proteiini: EGFR:n reitin epäsäännöllisyydellä on osuutta erilaisiin syöpiin. Testatakseen, ovatko vasta-aineet spesifisiä EGFR:lle tai jollekin sen jatkokohteista, tutkijat voivat tyrmätä kriittisiä proteiineja EGFR-reitillä ja nähdä, miten vasta-aineiden sitoutumissignaali muuttuu.

Viime vuosina CRISPR-Cas9-järjestelmä on tullut tunnetuksi luotettavimpana ja tehokkaimpana tapana tyrmätä geeni. Tämän vuoksi se on ihanteellinen testattaessa vasta-aineiden spesifisyyttä signaalikaskadin sisällä. Thermo Fisherin tutkijat ottivat vakiomuotoisen ihmisen karsinoomalinjan (A-431) ja käyttivät western blot -menetelmää sitoutumissignaalin perustason määrittämiseksi. Sitten he käyttivät CRISPR-Cas9:ää poistamaan kohdegeenin ja luomaan EGFR:n tyrmäyksiä. Western blot näistä knockout-soluista uutetusta proteiinista osoitti, että kohdeproteiinille ei enää ollut signaalia (kuva 1).

Jatkotestit vahvistivat tuloksen. EGFR:n jälkeiseen signaalikaskadiin kuuluu proteiineja, kuten RAS, RAF, MEK ja ERK. EGFR:n aktivoituminen epidermisen kasvutekijän (EGF) vaikutuksesta johtaa näiden alaketjun proteiinien fosforylaatioon, joka voidaan havaita käyttämällä muita vasta-aineita, jotka tunnistavat nämä fosforyloidut tilat. EGF:n lisääminen EGFR-knockout-soluihin ei kuitenkaan saisi johtaa fosforylaatioon. Samojen vasta-aineiden lisääminen, jotka tunnistavat fosforyloituja kohteita, ei tuottanut signaaleja. Näin ollen Thermo Fisherin tutkijat ovat varmoja siitä, että anti-EGFR-vasta-aine on kohdespesifinen.

Modifikaatioiden joukko

Solun ytimessä DNA on tiiviisti pakattu – kietoutunut histoniproteiinien ympärille muodostaen kromatiinia. Histonien tutkiminen on vaikeaa, sillä niihin voi vaikuttaa useita kemiallisia muutoksia, joita kutsutaan posttranslationaalisiksi modifikaatioiksi (PTM). Histonin jäännökset voivat esimerkiksi saada yhden tai useamman metyyli-, asetyyli- tai fosforyyliryhmän, joilla kullakin on vaikutusta solun toimintaan.

Tietyissä tekniikoissa, kuten kromatiinin immunoprecipitaatiossa (ChIP), western blottingissa, immunofluoresenssissa ja immunohistokemiassa, käytetään vasta-aineita, jotka kohdistuvat spesifisiin histonien PTM-modifikaatioihin, jotta voidaan ymmärtää histonin ja sen sitoutumisen tilaa. Useilla histonimodifikaatioilla on kuitenkin samankaltaiset DNA:n sitoutumismallit; vasta-aine, jota ei ole testattu tarkasti kaikkia histonien PTM:iä vastaan, saattaa sitoutua väärään tyyppiin ja antaa väärän positiivisen tuloksen.

Thermo Fisher testasi histonien PTM-spesifisiä vasta-aineitaan käyttäen erilaisia PTM:iä sisältäviä peptidejä. Jos vasta-aine on todella spesifinen yhdelle PTM:lle, se sitoutuu vain niihin pisteisiin, jotka kantavat kyseistä PTM:ää. Thermo Fisherin tutkijat mittasivat signaalit spesifisyyskertoimen avulla: kaikkien tiettyä PTM:ää sisältävien täplien keskimääräinen intensiteetti jaettuna kaikkien sellaisten täplien keskimääräisellä intensiteetillä, joissa PTM:ää ei ole (kuva 2). Vasta-aineet osoittivat 4-190 kertaa korkeampaa spesifisyyskerrointa kohteensa PTM-tiloille kuin ei-kohdetiloille, mikä antaa varmuuden siitä, että ne ovat erittäin selektiivisiä.

Thermo Fisherillä on seitsemän muuta spesifisyystestiä geneettisten knock out- ja peptidimassojen lisäksi. Näihin kuuluvat RNAi:n käyttö geeniekspression tyrmäämiseksi, eri tavoin kasvatettu vasta-aine kohdentumisen riippumattomaksi todentamiseksi ja luonnossa esiintyvä muuttuva ekspressio spesifisyyden vahvistamiseksi. Vain näin huolellisen ja tiukan testauksen avulla tutkijat voivat olla varmoja siitä, että heidän laboratorionsa työvälineet soveltuvat tarkoitukseensa – ja että heidän työnsä kestää tiukimmankin tarkastelun.

Täältä löydät näitä Invitrogenin vasta-aineita koskevat sovellusohjeet ja lisätietoja Thermo Fisher Scientificin kaksiosaisesta testaustavasta.