Proximity-Labeling MS (APEX-MS)

Tässä menetelmässä kiinnostava proteiini fuusioidaan peroksidaasiin (askorbiinihappoperoksidaasi; APEX). Käsiteltäessä H2O2:lla APEX muuntaa eksogeenisesti annostellun biotiini-fenolin biotiini-fenoksyyliradikaaleiksi, mikä johtaa proteiinin kovalenttiseen leimaukseen 20 nm:n säteellä. Tämän jälkeen biotinyloidut proteiinit rikastetaan Steptavidiinilla. Tämän tekniikan avulla voidaan ensimmäistä kertaa ottaa ”tilannekuvia” paikallisista proteiiniympäristöistä tiettynä ajankohtana ja tallentaa ohimeneviä proteiinien vuorovaikutuksia. Läheisyyteen perustuvat leimausmenetelmät ovat kehittyneet nopeasti viime vuosina, ja niiden on osoitettu täydentävän perinteisiä affiniteettipohjaisia puhdistusmenetelmiä (AP-MS), joten niillä on mahdollisuus avata täysin uusia tutkimusväyliä ja tarjota uutta tietoa proteiinien toiminnoista.

APEX:llä on voitu kaapata kokonaisia organellien proteomeja suurella ajallisella resoluutiolla, mutta sen leveyden leimauksen ajatellaan yleensä estävän korkeamman spatiaalisen resoluution, joka on tarpeen spesifisten proteiiniverkostojen tutkimiseksi. Olemme hiljattain tarjonneet ratkaisun tähän ongelmaan yhdistämällä kvantitatiivisen proteomiikan ja spatiaalisen referenssijärjestelmän. Tämän uudenlaisen menetelmän avulla voimme ratkaista tunnetut sitoutumiskumppanit sekä aiemmin tunnistamattomat verkostokomponentit, kuten hiljattain osoitettiin periaatepohjaisessa tutkimuksessa, jossa tutkittiin G-proteiinikytkentäisten reseptorien sitoutuneita proteiineja, kun ne dynaamisesti viestivät ja liikkuvat vastauksena ligandin aiheuttamaan aktivaatioon.