Viisi parasta menetelmää primaaristen vasta-aineiden leimaamiseen

Missä tahansa sovelluksessa, jossa käytetään vasta-aineita signaalin havaitsemiseen (esim. Western blotting, ELISA, immunohistokemia tai FACS), vasta-aineiden leimaamiseen on kaksi lähestymistapaa: suora ja epäsuora leimaaminen. Tavallisessa Western blotting -menetelmässä käytetään epäsuoraa leimausta, koska kohdeantigeenin havaitsemiseen käytetään primaarivasta-ainetta, jonka jälkeen käytetään sekundaarivasta-ainetta, johon on kiinnitetty havaintomolekyyli.

Jossain tilanteissa voi olla parempi jättää sekundaarivasta-aine ja kaikki siihen liittyvät vaiheet väliin ja leimata primaarivasta-aine suoraan. Tapauksia, jotka vaativat suoraa primaarisen vasta-aineen merkitsemistä, ovat esimerkiksi:

• Sekundäärivasta-aineen epäspesifinen sitoutuminen
• Käytät ei-spesifistävakio-organismien primaarivasta-aineita – tällöin voi olla vaikeaa löytää hyviä sekundaarivasta-aineita
• Kun tehdään multipleksointia vasta-aineilla, jotka ovat peräisin samoista lajeista
• Kun on lyhennettävä koeaikaa eliminoimalla sekundaarivasta-aineen inkubointi ja siihen liittyvät pesuvaiheet

Vasta-aineparametrit

Voit leimata valitsemasi vasta-aineen fluoresoivilla väriaineilla, mutta voit leimata sen lisäksi myös fluoresoivilla valkuaisaineilla, entsyymejä ja värillisiä partikkeleita. Kaikki nämä kiinnittyvät yleensä terminaalisen lysiiniryhmän kautta, joten sinun on vältettävä amiinipitoisia puskureita (esimerkiksi Tris) ja molekyylejä kaikissa vaiheissa. Muuten leimaat lähinnä puskurimolekyylit! Sinun tulisi myös välttää yleistä puskurin säilöntäainetta natriumatsidia, koska se häiritsee leimausreaktiota.

Merkitsemistä varten käytettävän vasta-aineen tulisi olla pitoisuudeltaan vähintään 0,5 mg/ml ja >90 % puhdas. Mitä vähemmän häiritseviä proteiineja ja aminoryhmiä sisältäviä molekyylejä vasta-ainevalmisteessa on, sitä tehokkaampi leimausreaktio on. Mutta vaikka vasta-aineesi uiskentelisi glysiinissä ja BSA:ssa, voit aina poistaa häiritsevät aineet dialyysillä. Voit myös parantaa vasta-aineesi puhtautta kuljettamalla sen A-proteiinikolonnin läpi tai voit jopa valmistaa oman affiniteettipuhdistuskolonnin sopivalla antigeenillä.

Pääasialliset talon sisäiset vasta-aineiden leimausmenetelmät

NHS-(sukkinimidyyli)esterimenetelmä

Menetelmä on käyttökelpoinen tunnistusmenetelmä, jolla voidaan konjugoida vasta-aineita laajalti saatavilla olevilla fluoresoivilla väriaineilla, kuten rodamiinijohdoksilla. Se suoritetaan tyypillisesti fosfaattipuskurissa, minkä jälkeen se erotetaan sarakkeessa leimaamattomasta väriaineesta. Suurin haittapuoli on, että esterit ovat epävakaita, koska ne ovat herkkiä kosteudelle. Merkitty vasta-aine on käytettävä heti reaktion päätyttyä.

Isotiosyanaattimenetelmä

Tällä menetelmällä voi valmistaa fluoreseiini-isotiosyanaattia (FITC), joka on hyvin suosittu fluoresoivien proteiinien ja vasta-aineiden valmistuksessa. Jos olet työskennellyt fluoresoivan mikroskopian parissa, olet ollut tekemisissä FITC:n kanssa. Saatavilla on myös eri standardiväriaineiden isotiosyanaattianalogeja.

Isotiosyanaatti on vakaampi kuin NHS, mutta sitä on vaikeampi valmistaa ja leimausreaktiosi on todennäköisesti vähemmän tehokas tällä menetelmällä. Kuten NHS:n kohdalla, ylimääräinen väriaine on poistettava reaktion jälkeen kromatografialla.

Karbodiimidimenetelmä

Karbodiimidiperäiset yhdisteet muuttavat proteiinien karboksyyliryhmiä reaktiivisiksi välituotteiksi, jotka voivat reagoida lysiinien kanssa. Karbodiimidien korkea reaktiivisuus tarkoittaa, että niitä voidaan käyttää vasta-aineiden merkitsemiseen suhteellisen inertillä materiaalilla, kuten magneetti- tai kultahiukkasilla. Yleisimmin käytetty karbodiimidi on EDC. Joskus reaktioon lisätään NHS:ää suhteellisen stabiilien välituotteiden muodostumisen helpottamiseksi.

Menetelmä on yksinkertainen, mutta NHS:n tavoin EDS on hygroskooppinen, joten vasta-aine on käytettävä välittömästi leimaamisen jälkeen.

Kahden tagin menetelmä

Tässä vasta-ainetta leimataan toisella proteiinilla, joka toimii katalysaattorina, esimerkiksi HRP:llä tai emäksisen fosfataasin kanssa. Koska molemmat molekyylit sisältävät lukuisia aminoryhmiä, suora ristisidonta (kuten NHS-menetelmässä) johtaisi saman molekyylin polymeereihin. Sen vuoksi linkitys suoritetaan kahdessa erillisessä vaiheessa. Ristisilloitat vasta-aineen molekyyliin X ja katalyytin molekyyliin Y. Sinun on valittava X ja Y huolellisesti, koska niiden pitäisi vuorovaikuttaa keskenään konjugaatin muodostamiseksi. Voit esimerkiksi valita maleimidin X:ksi ja tiolin Y:ksi.

Vaikka tuloksena saatava konjugaatti on vakaampi kuin NHS-menetelmällä saatava, tämä menetelmä vaatii kolminkertaisen työmäärän; erilliset merkintä- ja puhdistusvaiheet vasta-aineelle, katalyytille ja konjugaatioreaktiolle. Hyvä uutinen on, että voit ostaa valmiiksi leimattua katalyyttimolekyyliä ja sitten leimata vasta-aineesi sen mukaisesti.

Periodaattimenetelmä

Tämä menetelmä on käyttökelpoinen spesifisten HRP-vasta-ainekonjugaattien tuottamiseen. Periodaatti aktivoi HRP:n luomalla aldehydimolekyylejä, jotka ovat vuorovaikutuksessa lysiinijäämien kanssa. Itse HRP:ssä on vain muutama lysiinijäännös, joten entsyymin polymerisaatio ei ole merkittävä huolenaihe. HRP:n ja vasta-aineen väliset sidokset ovat palautuvia, ellei niitä stabiloida lisäämällä natriumsyanohydridiä.

Tässä oli minun listani parhaista kotitekoisista vasta-aineiden leimausmenetelmistä. Markkinoilla on paljon kaupallisia sarjoja, joilla on samanlainen peruskemia ja jotka voivat tehdä elämästäsi paljon helpompaa. Jos laboratoriollasi on rahaa.

Onko sinulla jokin muu vasta-aineiden leimausmenetelmä, jonka haluaisit jakaa kanssamme? Ota yhteyttä kirjoittamalla kommenttiosioon.

Kirjallisuus:

Meyer JP, Adumeau P, Lewis JS, Zeglis BM. Click Chemistry and Radiochemistry: The First 10 Years. Bioconjug Chem. (2016) 27(12):2791-2807. doi: 10.1021/acs.bioconjchem.6b00561. Epub 2016 Nov 22.