Yleisesti käytetyt apoptoosimääritykset apoptoositutkimuksessa
Kysymys:
Mitkä ovat yleisimmin käytettyjä apoptoosimäärityksiä?
The Protein Man Says:
Apoptoositutkimus edellyttää monenlaisten apoptoosiassien käyttöä, koska itse prosessi on varsin monimutkainen. Lisäksi ei ole olemassa yhtä ainoaa parametria, joka määrittelisi solukuoleman kaikissa järjestelmissä, joten tutkimuksessa on käytettävä useita lähestymistapoja.
Apoptoosimääritysten päätyypit
Apoptoositutkimuksessa käytetään tällä hetkellä viittä eri tyyppistä apoptoosimääritystä. Näihin kuuluvat kaspaasimääritykset, DNA-fragmentaatiomääritykset, solun läpäisevyysmääritykset ja mitokondriomääritykset. Lisäksi on olemassa myös eräänlainen määritystyyppi, jota voidaan käyttää apoptoosin signalointireittien analysoinnin helpottamiseksi.
Kaspaasimääritykset. Kaspaasientsyymien esiintyminen missä tahansa näytteessä on varma indikaattori siitä, että apoptoosiin liittyvät monimutkaiset biokemialliset tapahtumat ovat käynnissä. Näin ollen kaspaasimäärityksiä voidaan käyttää apoptoosin havaitsemiseen solupopulaatioissa sen varhaisimmissa vaiheissa. Näissä määrityksissä käytetään rutiininomaisesti spesifisiä substraatteja, jotka kaspaasit pilkkovat vapauttaen kolorimetrisiä tai fluorometrisiä substraatteja.
DNA-fragmentointimääritykset. Apoptoosi ja DNA:n pilkkoutuminen kulkevat käsi kädessä, joten voit määrittää apoptoosin laajuuden mittaamalla näytteessä olevia DNA-fragmentteja. Useimmat tutkijat käyttävät tähän tarkoitukseen apoptoottisen DNA:n tikapuuanalyysiä, ELISA-kvantitatiivista määritystä ja TUNEL-määrityksiä (terminaalinen deoksinukleotidyylitransferaasi dUTP nick end labeling).
Solunläpäisevyysmääritykset. Keskivaiheen apoptoosi voidaan määrittää käyttämällä solunläpäisevyysmäärityksiä. Kuten luultavasti tiedät, terveillä soluilla on jäykät plasmakalvot, kun taas kuolleilla soluilla on erittäin läpäisevät solukalvot. Koska fluoresoivien väriaineiden kalvot ovat erittäin heikentyneet, ne läpäisevät helposti apoptoottiset solut. Kun näin tapahtuu, havaitaan tyypillinen fluoresenssi- tai värjäytymiskuvio, joka osoittaa, että näytteessäsi on apoptooppisia solupopulaatioita.
Solujen läpäisevyyden lisääntyminen johtaa myös sytosolisten proteiinien häviämiseen solusta. Laktaattidehydrogenaasi (LDH) on liukoinen sytosolinen entsyymi, joka vapautuu elatusaineeseen joko apoptoosin tai nekroosin aiheuttaman kalvon eheyden menetyksen seurauksena. LDH-aktiivisuutta voidaan näin ollen käyttää solukalvon eheyden indikaattorina ja se toimii yleisenä keinona arvioida kemiallisten yhdisteiden tai ympäristötoksisten tekijöiden aiheuttamaa sytotoksisuutta. Vapautuvan LDH:n kvantifiointiin on olemassa useita määrityksiä.
Mitokondriomääritykset. Mitokondriomääritykset voivat auttaa apoptoosin alkuvaiheen määrittämisessä, koska niissä käytetään kationista väriainetta, joka tuottaa erilaista fluoresenssia, kun sitä käytetään terveissä solupopulaatioissa ja apoptooppisissa solupopulaatioissa.
Tietäminen siitä, mitä apoptoosimäärityksiä on käytettävä ja milloin niitä on käytettävä, voi olla suureksi avuksi tutkimuksessasi, joten sinun on parasta alkaa tuntea ne ulkoa.