Inhibitor of Apoptosis Proteins: Transpunerea cunoștințelor de bază în practica clinică

BY admin
|

Familia de proteine inhibitoare de apoptoză a inhibitorilor de caspază

IAP-urile sunt o familie de inhibitori de caspază care inhibă în mod specific caspazele 3, 7 și 9 și, prin urmare, previn apoptoza. Crook et al. (17) au identificat primul membru al familiei IAP în mod întâmplător în timp ce studiau apoptoza indusă de vAcAnh în celulele baculovirus SF21. În timpul unui screening pentru genele baculovirusului care imitau acțiunile p35 și inhibau apoptoza indusă de vAcAnh, aceștia au identificat o nouă genă de 1,6 kb care codifica o proteină antiapoptotică de 31 kDa cu un motiv asemănător cu un deget de zinc (17). Studii ulterioare au identificat IAPs într-o gamă diversă de specii și au discernut că IAPs inhibă apoptoza prin blocarea caspaselor (revizuit în ref. 18).

Familia proteinelor inhibitoare de apoptoză

Până în prezent, au fost identificați opt membri ai familiei IAP umane (Fig. 2)⇓, iar omologii IAP au fost, de asemenea, descriși la insecte și la drojdii. Proteinele IAP sunt grupate în această familie pe baza prezenței a unul până la trei domenii IAP repeat (BIR) din baculovirus, o regiune de legare a zincului de ∼70 aminoacizi. Deși domeniul BIR este necesar pentru apartenența la familia IAP, nu toate proteinele care conțin BIR par să aibă funcții antiapoptotice (19, 20, 21, 22), astfel încât prezența unui domeniu BIR este necesară, dar nu suficientă pentru includerea în această familie de proteine. Proteinele IAP pot conține, de asemenea, un domeniu RING sau un domeniu de recrutare a activării caspazelor (CARD) (analizat în ref. 18). Proteinele IAP au fost împărțite în trei clase (clasele 1, 2 și 3) pe baza prezenței sau absenței unui deget RING și a omologiei domeniilor BIR (23).

Fig. 2.

Familia de proteine IAP. Până în prezent, au fost identificați opt membri ai familiei IAP umane, pe baza domeniilor BIR comune. Membrii IAP pot conține, de asemenea, un domeniu CARD și un motiv RING finger. BRUCE are un motiv de enzimă de ubiquitinare E2 (Ubc), iar NAIP are un domeniu de legare a nucleotidelor (NB). Pentru a grupa proteinele IAP, acestea au fost împărțite în trei clase (clasele 1-3), pe baza prezenței sau absenței unui deget RING și a omologiei domeniilor BIR.

Proteinele inhibitoare ale apoptozei din clasa 1.

Proteinele IAP din clasa 1 conțin domenii BIR omologe și un motiv de deget RING. IAP legat de X are trei domenii BIR și un deget RING. A fost prima IAP din această clasă care a fost identificată și rămâne cea mai bine caracterizată. Duckett și colab. (24) au identificat XIAP în 1996 în cadrul unei căutări de gene de mamifere omoloage cu IAP din baculovirus. Aceasta se leagă și inhibă caspazele 3, 7 și 9 cu o afinitate nanomolară, dar nu se leagă și nu inhibă caspaza 8 (25, 26). cIAP1 (cunoscută și sub numele de MIHB, hiap2 și BIRC2) și cIAP2 (cunoscută și sub numele de MIHC, hiap2 și BIRC3) sunt înrudite structural cu XIAP cu trei domenii BIR și un deget RING. Aceste IAPs au fost identificate prin purificarea biochimică a proteinelor asociate cu receptorul de moarte TNF-R2, dar rolul lor la acest receptor rămâne neclar (27). cIAP1 și cIAP2 sunt exprimate în majoritatea țesuturilor umane, dar expresia cIAP1 este mai mare în timus, testicule și ovare, iar expresia cIAP2 este mai mare în splină și timus (27). cIAP1 și cIAP2 se leagă și inhibă caspaza 3 și 7, deși mai puțin puternic decât XIAP (25). Ele nu inhibă caspazele 1, 6 și 8. ML-IAP (cunoscută și sub numele de livin, KIAP și BIRC7) și ILP-2 au un deget RING și un singur domeniu BIR, dar domeniul BIR al acestora este cel mai asemănător cu domeniul BIR3 al XIAP, cIAP1 și cIAP2 (de unde și includerea lor în această clasă). ML-IAP este exprimată în ficatul fetal normal, în rinichi, în testiculul și timusul adulților, precum și în liniile celulare de melanom și limfom. ML-IAP inhibă caspazele 3 și 9 cu o afinitate similară cu cea a cIAP1, dar nu se leagă sau inhibă caspazele 1, 2, 6 sau 8 (28). Expresia ILP-2 este în mod normal limitată la testiculul adult, dar a fost documentată, de asemenea, într-o linie celulară limfoblastoidă. ILP-2 inhibă caspaza 9, dar nu și caspazele 3, 7 sau 8 (29). Rămâne de stabilit dacă variațiile de afinitate pentru caspaze între diferitele IAP au legătură cu funcțiile intracelulare endogene ale acestora.

Proteine inhibitoare ale apoptozei de clasa 2.

Membrul familiei IAP de clasa 2, NAIP, are trei domenii BIR, dar nici un motiv RING finger. Domeniile sale BIR sunt înrudite mai îndepărtat cu domeniile BIR ale IAP-urilor din clasa 1. NAIP a fost identificat în 1995 de Roy et al. (30), în timp ce căutau gena de pe 5q13 responsabilă de atrofiile musculare spinale din copilărie. NAIP este exprimată în ficatul adult, în placentă și în sistemul nervos central. Inhibă caspazele 3 și 7, dar nu și caspazele 1, 4, 5 sau 8 (31).

Proteine inhibitoare ale apoptozei de clasa 3.

Membrii IAP de clasa 3, cum ar fi survivina, conțin doar un singur domeniu BIR și niciun deget RING. Survivin este exprimată în ficatul fetal, rinichi, plămâni și tractul gastrointestinal, dar nu este exprimată în majoritatea țesuturilor normale ale adulților (32). Exprimarea preferențială a survivinei în țesutul fetal sugerează că aceasta joacă un rol în dezvoltare. Survivina este frecvent supraexprimată într-o varietate de tumori maligne, inclusiv adenocarcinoame ale plămânului, pancreasului, colonului, sânului și prostatei (32, 33, 34, 35, 36).

Expresia diferențială între celulele normale și cele maligne poate fi exploatată în scopuri terapeutice. De exemplu, promotorul survivin ar putea fi utilizat ca promotor specific tumorii, în care o genă de interes este activată în celulele maligne, dar nu și în celulele normale. Această direcționare transcripțională poate fi utilă în terapia genică a cancerului (37). Alternativ, expresia survivinei ar putea fi utilizată ca marker tumoral pentru identificarea timpurie a malignității, după cum se discută în detaliu mai jos.

Proteinele inhibitoare ale apoptozei inhibă caspele active

Inhibarea caspazelor este cel mai bine înțeles mecanism prin care IAP-urile previn apoptoza. În reacțiile enzimatice, XIAP recombinant inhibă caspaza 3, 7 și 9, dar nu și caspaza 8. In vitro, supraexprimarea XIAP în celulele 293T previne scindarea indusă de BAX și FAS a procaspazei 3 și apoptoza (38). Efectul XIAP asupra activării caspazei a fost atribuit domeniilor sale BIR, domeniul BIR2 inhibând caspazele 3 și 7, iar domeniul BIR3 RING inhibând caspaza 9.

Bazele structurale ale inhibării caspazei de către proteina inhibitoare a apoptozei legată de X-Linked.

Datorită datelor celulare și enzimatice care indică faptul că IAP-urile inhibă caspazele, s-au depus eforturi pentru a explora interacțiunile fizice dintre IAP-uri și caspaze. Majoritatea studiilor s-au concentrat asupra XIAP deoarece poate fi produsă sub formă recombinantă și cristalizată. XIAP inhibă caspazele 3 și 7 și caspaza 9 prin intermediul unor domenii separate. Domeniul său BIR2 (aminoacizii 163-240) cu extensia sa NH2-terminală (aminoacizii 124-162) inhibă caspazele 3 și 7, în timp ce domeniul BIR3 (aminoacizii 241-356) inhibă caspaza 9 (39). Aceste studii au constituit baza pentru dezvoltarea de inhibitori IAP care vizează buzunarele de legare la caspază ale moleculei.

Domeniul BIR2 inhibă proteina X-Linked Inhibitor of Apoptosis Protein.

A fost propus un model „cârlig, undiță și chiuvetă” pentru a explica modul în care XIAP inhibă caspaza 3 (Fig. 3)⇓. „Cârligul” (reziduurile 138-146 ale terminației NH2) inhibă capaza 3 prin așezarea peste situsul activ al caspazei, blocând astfel buzunarul de legare a substratului caspazei 3 active. „Linia” reprezintă două legături peptidice pe Val147 care leagă cârligul de sinker. „sinkerul” (reziduurile 148-150) stabilizează interacțiunea dintre XIAP și caspaza 3 (40). În acest model, XIAP inhibă caspaza 3 prin împiedicare sterică. Ca atare, inhibă caspazele 3 și 7 printr-un mecanism diferit de cel al inhibitorilor peptidil caspazei, cum ar fi benziloxicarbonil-VAD-fluorometil cetona, care concurează cu substratul caspazei pentru buzunarul de legare.

Fig. 3.

Modelul cârligului, liniei și plutei pentru inhibarea caspazei de către XIAP. Un model de cârlig, linie și chiuvetă poate explica modul în care XIAP inhibă caspaza 3 prin împiedicare sterică. Cârligul din prelungirea NH2-terminală a domeniului BIR2 al XIAP inhibă caspaza 3 prin așezarea peste situsul activ al caspazei, blocând astfel buzunarul de legare a substratului din caspaza 3 activă. Linia este formată din două legături peptidice care leagă cârligul de sinker. Siderul stabilizează interacțiunea dintre XIAP și caspaza 3.

Domeniul BIR3 inhibă proteina X-Linked Inhibitor of Apoptosis Protein.

Studii timpurii au determinat că domeniul BIR3 al XIAP ar putea inhiba caspaza 9 (26, 41), dar numai recent a fost elucidat mecanismul. Domeniul BIR3 al XIAP formează un heterodimer cu caspaza 9 monomerică, împiedicând astfel dimerizarea și activarea caspazei 9. Pe lângă faptul că prinde caspaza 9 într-o formă monomerică, acesta menține, de asemenea, situsul activ al caspazei 9 într-o conformație inactivă (42). Astfel, este interesant de observat că XIAP inhibă caspaza 9 fără a atinge fizic situsul activ.

Într-o extensie a studiilor structurale, au fost examinate efectele mutațiilor în domeniile BIR asupra efectelor antiapoptotice ale XIAP. Mutațiile care afectează extensia NH2-terminală a BIR2 (de exemplu, D148A) anulează rolul protector al XIAP în prevenirea apoptozei induse de ligandul Fas (un stimulent al căii extrinseci de activare a caspazelor) sau de Bax (un stimulent al căii intrinseci de activare a caspazelor). În schimb, mutațiile care afectează domeniul BIR3 (de exemplu, W310A) reduc inhibarea mediată de XIAP a apoptozei induse de BAX, dar nu de CD95 (43). Astfel, aceste mutații susțin studiile structurale care demonstrează că domeniul BIR2 este necesar pentru inhibarea caspazei 3 și că domeniul BIR3 inhibă caspaza 9.

Survivin.

În timp ce XIAP inhibă caspazele 3, 7 și 9 prin interacțiuni directe, mecanismul prin care survivin inhibă caspazele este mai puțin clar. Conform unor studii (44, 45), survivina se leagă și inhibă caspazele active 3 și 7, dar nu și caspaza 8. În schimb, alții (46) nu detectează o interacțiune a survivinei cu caspaza 3. Un studiu realizat de Marusawa și colab. (47) a raportat că survivina nu inhibă caspazele recombinante 3, 7 sau 9 în reacții enzimatice sau în extracte citosolice stimulate în prealabil cu citocrom c și dATP. Cu toate acestea, atunci când survivina este adăugată în extractele citosolice înainte de activarea caspazei 9 prin adăugarea de citocrom c și dATP, aceasta previne activarea caspazei 3/7. Astfel, aceste rezultate sugerează că survivina inhibă caspaza 9 activă, dar nu și caspazele 3 și 7 active, și că inhibarea caspazei 9 necesită un cofactor. Pentru a identifica un astfel de cofactor, Marusawa și colab. (47) au folosit un ecran cu două hibride pentru a identifica proteinele de legare a survivinei și au identificat HBXIP. În reacțiile enzimatice, survivina și HBXIP în combinație (dar niciuna dintre proteine singură) a inhibat activitatea caspazei 9. Vor fi necesare studii suplimentare pentru a rezolva aceste studii discordante și pentru a descifra mecanismul prin care survivina inhibă caspazele. În plus, pentru a generaliza importanța HBXIP ca și cofactor necesar pentru survivină, aceasta va trebui să fie evaluată în alte sisteme celulare. O astfel de lucrare va fi un pas important în direcția dezvoltării de inhibitori chimici ai survivinei.

Peste inhibarea caspazelor

Cel mai mult atenția s-a concentrat asupra IAP-urilor ca inhibitori ai caspazelor, dar mai multe linii de dovezi indică faptul că IAP-urile pot inhiba apoptoza prin efecte asupra progresiei ciclului celular, diviziunii celulare și transducției semnalelor.

Proteinele inhibitoare ale apoptozei reglează diviziunea celulară.

Proteinele IAP joacă probabil un rol în diviziunea celulară. De exemplu, drojdia nu are caspaze, dar are omologi IAP care conțin un domeniu BIR. Ștergerea IAP din drojdie duce la formarea ineficientă a sporilor, ceea ce indică faptul că, cel puțin în cazul drojdiei, IAP joacă un rol în meioză (20, 21, 22). În celulele mamiferelor, survivina se colocalizează cu aparatul mitotic, inclusiv cu tubulina B, microtubulii, centrosomii și kinetochores (48, 49, 50). Inhibarea survivinei cu un anticorp anti-survivină are ca rezultat întârzierea metafazei și produce celule mitotice cu fusuri mitotice mai scurte și mai puțin dense (48, 50).

Proteinele inhibitoare ale apoptozei reglează progresia ciclului celular.

Evidențele implică, de asemenea, IAP-urile ca regulatori ai ciclului celular. De exemplu, supraexprimarea XIAP oprește celulele în faza G0-G1 a ciclului celular, iar această oprire a creșterii este asociată cu reglarea în jos a ciclinei A și D1 și cu inducerea inhibitorilor kinazei dependente de ciclină p21 și p27 (51). În plus, XIAP se leagă de regulatorii ciclului celular MAGE-D1 și NRAGE, dar semnificația acestei interacțiuni este neclară (52). Survivina a fost, de asemenea, implicată în reglarea ciclului celular. În celulele HeLa, survivina este practic nedetectabilă în celulele G1 și crește de ∼5- și, respectiv, de 40 de ori în celulele în faza S și G2-M (50). Modificările nivelului de ARNm al survivinei se corelează, de asemenea, cu creșteri ale proteinei survivină și ale activității promotorului.

Proteinele inhibitoare ale apoptozei reglează semnalizarea celulară.

Familia de proteine IAP joacă, de asemenea, un rol în semnalizarea celulară prin activarea factorului nuclear (NF)-κB. XIAP și NAIP, de exemplu, formează un complex cu kinaza TAK1 și cofactorul său, TAB1, care duce la activarea c-Jun-NH2-terminal kinazei 1 (53). C-Jun-NH2-terminal kinaza 1 activată activează ulterior NF-κB prin cascada de fosforilare a proteinei kinazei activate de mitogen (54). În plus, XIAP promovează translocarea subunității NF-κB p65 în nucleu, care este o condiție prealabilă pentru activitatea NF-κB (55). În cele din urmă, XIAP promovează degradarea inhibitorului NF-κB Iκβ (51).

Pe măsură ce se clarifică rolul IAP-urilor în reglarea diviziunii celulare, a ciclului celular și a transducției semnalelor, va fi important să se identifice domeniile IAP responsabile de aceste activități. Dacă devine posibilă identificarea domeniilor separate ale proteinelor care inhibă caspele, ciclul celular și transducția semnalului, atunci ar putea fi realizate IAP-uri mutante care să disocieze aceste funcții. Această lucrare ar putea conduce la dezvoltarea de inhibitori IAP care să blocheze în mod specific inhibarea caspaselor de către IAP, în timp ce IAP își păstrează rolul de regulatori ai ciclului celular și ai transducției semnalului.

Reglarea funcției proteinei inhibitoare a apoptozei de către proteinele inhibitoare endogene

Membrii familiei IAP sunt reglați la nivelul genei, mesajului și proteinei, dar detaliile acestei reglări depășesc sfera de aplicare a acestei analize. Mai degrabă, această trecere în revistă se va concentra pe reglarea IAP-urilor de către proteinele inhibitoare endogene, deoarece acestea servesc drept prototipuri pentru inhibitorii chimici terapeutici ai IAP-urilor.

Proteinele reglatoare de legare a IAP-urilor au fost identificate pentru prima dată la Drosophila. S-a demonstrat că proteinele Reaper, Hid, Grim (56) și Sickle (57) se leagă și inhibă IAP din Drosophila, DIAP1. Ulterior, versiunile umane ale proteinelor Reaper (Rpr), Hid, Grim (Grm) și Sickle (Skl) au fost identificate și denumite SMAC/DIABLO și HTRA2. Acești inhibitori IAP au în comun o secvență omoloagă în terminația lor NH2 care este responsabilă pentru legarea și inhibarea IAP (Fig. 4)⇓.

Fig. 4.

Familia SMAC a inhibitorilor IAP. Membrii familiei SMAC de inhibitori IAP au în comun o regiune NH2-terminală omoloagă. Terminația NH2 este suficientă pentru legarea domeniului BIR3 al XIAP.

SMAC și HTRA2.

SMAC și HTRA2 umane sunt proteine mitocondriale care sunt eliberate împreună cu citocromul c în timpul dezmembrării mitocondriei. La eliberare, acestea sunt scindate într-o formă activă. În starea lor activă, SMAC și HTRA2 se leagă de IAP-uri, împiedicând astfel asocierea lor cu caspele (58, 59, 60, 61). Funcțiile de inhibare a IAP ale familiei de proteine SMAC sunt codificate în terminalul NH2 al acestora. Peptidele care corespund celor șapte aminoacizi NH2-terminali sunt capabile să se lege de XIAP (62). Mutarea alaninei NH2-terminale în glicină anulează capacitatea peptidei SMAC de a se lega de IAP și de a-și exercita funcția proapoptotică (63). Atunci când sunt internalizate în celule, peptidele care corespund celor șapte aminoacizi NH2-terminali ai SMAC sunt capabile să sensibilizeze celulele canceroase pulmonare H460 la cisplatin și Taxol (64) și celulele de neuroblastom la ligandul inductor de apoptoză legat de factorul de necroză tumorală . Rezultate similare au fost observate cu HTRA2 și cu inhibitorii IAP la Drosophila. Proprietățile antitumorale ale peptidelor SMAC au fost extinse la xenogrefe, unde versiunile permeabile la celule ale acestor peptide micșorează tumorile atunci când sunt combinate cu cisplatin (64) sau TRAIL (65) în xenogrefe de carcinom pulmonar și, respectiv, de gliom. Astfel, aceste peptide SMAC servesc drept prototipuri pentru molecule mici care imită acțiunile SMAC și inhibă IAPs și ar fi utile din punct de vedere terapeutic pentru o varietate de tumori maligne.

Studii structurale.

Datorită potențialului de utilitate clinică a moleculelor asemănătoare SMAC, s-au depus eforturi pentru a înțelege interacțiunile fizice dintre SMAC și IAPs. Studiile structurale au demonstrat că SMAC se leagă de XIAP în două locuri distincte. Terminația NH2 a SMAC activ (reziduurile 56-59) se leagă de buzunarul BIR3 al XIAP și inhibă competitiv domeniul BIR3 de la legarea caspazei 9. Mutațiile în domeniul BIR3 care împiedică legătura cu caspaza 9 (de exemplu, W310) împiedică, de asemenea, domeniul BIR3 să se lege de SMAC, sugerând că situsurile de legătură ale SMAC și caspazei 9 se suprapun. Cu toate acestea, situsurile de legare nu sunt identice, deoarece unele mutații în BIR3 (de exemplu, H343A) anulează legarea BIR3 la caspaza 9, dar nu și la SMAC (63, 66).

Proteina de lungime completă SMAC și peptidele NH2-terminale se leagă, de asemenea, de domeniul BIR2 al XIAP, dar cu o afinitate de ∼5- până la 10 ori mai mică decât cea pentru BIR3. Mecanismul prin care SMAC întrerupe asocierea BIR2 de caspaza 3 nu este clar, dar poate fi legat mai mult de obstacolul steric decât de legarea competitivă (63).

HTRA2 se leagă de domeniul BIR3 al XIAP, dar cu o afinitate mai slabă decât SMAC (67). În starea sa activă, HTRA2 există ca un trimer, iar mutațiile care împiedică formarea trimerului îl fac pe HTRA2 inactiv. În plus față de inhibarea IAP-urilor prin legarea buzunarului BIR3, HTRA2 poate, de asemenea, să cliveze și să inactiveze mai multe IAP-uri, inclusiv XIAP, cIAP1 și cIAP2, dar nu și survivina (68).

SMAC β.

SMAC și HTRA2 își pot exercita, de asemenea, activitatea proapoptotică prin efecte independente de legarea IAP. Un studiu realizat de Roberts et al. (69) a descris o formă de îmbinare alternativă a SMAC care apare în mod natural, denumită SMAC β, care nu are secvența de direcționare mitocondrială. SMAC β nu a interacționat cu XIAP, cIAP1 sau cIAP2, probabil din cauza pierderii terminației sale NH2. Deși nu se poate lega de IAPs, SMAC β a îmbunătățit apoptoza mediată de TRAIL și VP-16 în celulele 293. De asemenea, versiunile mutante ale HTRA2 (67) care nu sunt capabile să se lege de IAPs sunt încă capabile să inducă apoptoza atunci când sunt supraexprimate în celulele de cancer de sân MCF7. Acest studiu nu clarifică modul în care aceste forme de splice alternative pot totuși induce apoptoza. Poate că acestea își păstrează capacitatea de a ubiquitina IAP, promovând astfel distrugerea IAP. Alternativ, este posibil ca SMAC și HTRA2 să aibă parteneri de legare suplimentari care nu au legătură cu IAP-urile și prin care exercită o influență proapoptotică. În cazul HTRA2, acesta are o activitate proteazică independentă de rolul său de legare a IAP-urilor, iar această activitate proteazică poate regla apoptoza în unele sisteme (68).

XAF1.

XAF1 este un alt inhibitor al IAP-urilor. XAF1 este o proteină nucleară care se leagă și sechestrează XIAP în nucleu. În reacțiile biochimice, XAF1 se leagă și inhibă XIAP. În celule, supraexprimarea lui XAF1 blochează inhibarea apoptozei mediată de XIAP. Cu toate acestea, rămâne neclar dacă sechestrarea XIAP în nucleu separă pur și simplu XIAP de caspazele citosolice sau dacă există efecte suplimentare ale XIAP localizate în nucleu (70). Moleculele care imită XAF1 ar funcționa probabil diferit de SMAC și ar fi o strategie alternativă la dezvoltarea unui inhibitor XIAP.

.