Adventivrot
Metoder för rotning av mikroskott
Om mikroskott inte bildar rötter under förökningsstadiet måste de få särskild behandling för att initiera och odla ett adventivt rotsystem. Mikroshoots kan rotas in vitro och sedan acklimatiseras till den omgivande miljön, eller så kan de rotas ex vitro och på så sätt kombinera rotning och acklimatisering.
Lätthet och framgång för rotning avgör vilken metod som används på en viss kultursort. Den mer kostnadseffektiva metoden är att rota mikroskott ex vitro. Ex vitro-rötning sparar en ytterligare in vitro-överföring till rotningsmedium och påskyndar acklimatiseringen, vilket gör mikroförökningen effektivare. In vitro-rötning används om det saknas anläggningar för ex vitro-rötning och acklimatisering, om det är svårt att lyckas med ex vitro-rötning och om laboratorieföreståndaren bedömer detta.
In vitro-rötning. Ingredienserna i mediet och inkubationsförhållandena är lätta att ändra när in vitro-förhållanden används för att främja rotinitiering och tidig utveckling. Näringssaltsformuleringarna kan förbli desamma, ändras eller minskas, ofta till halva styrkan av makrosalter, och den relativa fuktigheten kan minskas genom användning av ventilerade lock (figur 5). Inkuberingsförhållandena för ljus- och temperaturkulturer kan ändras för rötning. Många mikroskott inkuberas i mörker under en period för rotinitiering och överförs sedan till ljusa förhållanden.
Figur 5. Kirurgisk mikroporetejp ger ventilation till detta kärl med skott som rotar sig. Detta bidrar till att minska den relativa fuktigheten och förbereder de nya plantorna för växthusmiljön.
Näringsmediet för rotning som nyklippta mikroskott placeras på innehåller i allmänhet auxin. Vanligtvis tillsätts mikromolära koncentrationer av IBA och/eller NAA till mediet före autoklavering. Koncentrationen av auxin beror på art och sort. Denna information finns vanligtvis tillgänglig online med hjälp av en vetenskaplig sökmotor, t.ex. Google Scholar http://scholar.google.com/. Vanligtvis ger växtnamnet, orden ”vitro” och ”root” (eller adventivrot) i söksträngen specifik information. Om det saknas litteratur för en viss växt, använd nära släktingar i sökningen för att avgöra hur de reagerade.
Då det är känt att samma koncentrationer av auxin som stimulerar initiering av adventivrot kan hämma rotutvecklingen, använder vissa en metod med två medier. När mikroskott av Cotinus coggygria stod på medium som innehöll 10 µM IBA i 5 dagar innan de överfördes till auxinfritt medium, rotade 100 %; medan endast 40 % rotade vid kontinuerlig odling på medium med 10 µM IBA (Metivier et al., 2007). Padilla och Burgos (2010) odlade olivmikroskott på medier som innehöll upp till 4 µM IBA i 2 veckor följt av överföring till basmedium utan auxin som resulterade i 65-93 % rotning, beroende på sort.
I vissa fall har IBA-lösningar applicerats på mikroskott som en basdoppning i en minut eller mer. Tsvetkov et al. (2007) fick sin bästa rotning av Sorbus domestica-mikroskott när de doppades i en 14,8 µM IBA-lösning i 80 s innan de placerades på basalmedium.
Mörker under eller före rotning kan öka rotningsframgången och synkroniseringen av rotning mellan mikroskott. Etiolering, utveckling av skott utan ljus, ökar den cellulära kompetensen för adventiv rotning (Murray et al., 1994). När valnötsmikroskott var etiolerade var rotningen bättre med snabbare uppkomst av rötter än från gröna skott (Leslie et al., 2010); de etiolerade skotten var dock spröda och krävde försiktigare hantering.
Kulturering av gröna mikroskott på rotningsmedium i mörker under en relativt kort period kan avsevärt förbättra rotningen. En period av mörker i 4-7 dagar på ett halvstarkt Murashige och Skoog-medium som innehåller 1 µM phloroglucinol och 1,4 µM IBA följt av inkubation under ljusa förhållanden resulterade i bättre rotning av ”Delicious”-äpple-mikroskott än om de odlades enbart i ljus eller i mörker under längre perioder (Zimmerman, 1984). Vid odling av mikroskott av äppelrotstocken ”MM106” på medium med 4 µM IBA i mörker i 0-10 dagar upptäcktes genom histologisk undersökning att rotinduktion skedde under de första tre dagarna eller mindre i mörker och att koniska rotprimordier var synliga vid dag 7 (Naija et al., 2008). Tidpunkten för behandling i mörker är kritisk och kan behöva bestämmas för varje gröda eller genotyp, men det kan ändå avsevärt öka rötningsframgången.
Vissa arter rotar sig bäst om topparna av mikroskotten är upplysta och den basala delen i mediet är i mörker, på samma sätt som makroskott rotar sig i ett växthusmedium under dimma. Mörkläggning av mediet kan åstadkommas genom att man målar odlingskärlens utsida svart till något över mediets nivå och täcker mediet med sterilt polykarbonatgranulat eller annat ljusavstängande ämne, eller genom att mörklägga själva mediet genom att tillsätta aktivt kol. Ibland används ett växthusmedium, t.ex. vermiculit, som också utesluter ljus, för in vitro-rötter efter att ha fuktats med näringsmediet.
Det har visats att mörkfärgning av endast basen av mikroskott ökade rötningen av mandel, persika och oliv (Rugini, 1988) och äpple (Mencuccini och Rugini, 1993) jämfört med kontroller som inkuberades antingen i mörker eller under ljus. I en separat studie rapporterade Mencuccini och Rugini (1993) dock att mörkfärgning av basen hade liten effekt på rotning av mikroskott av mandel, aprikos, kastanj, jojoba och oliv och att den var hämmande för valnöt. Om rötningsframgången är lägre än vad som är önskvärt kan därför basal mörkfärgning vara till hjälp.
Ex vitro rötning. Om roteringsprocenten är likartad kan ex vitro rotering vara effektivare och mer kostnadseffektiv än in vitro rotering (Leva, 2011). Kostnaderna är högre vid rötning in vitro på grund av ingredienser, förberedelsetid, autoklavering av media, arbetskraft för överföringar och förflyttning av kulturer samt inkubationsutrymme. Förflyttningen till växthuset är likartad mellan in vitro- och ex vitro-rötning, och transplantationstiden kan vara likartad eller långsammare när det finns rötter på mikroskotten (figurerna 4 och 6). Effektiviteten ökar genom rötning ex vitro. Det har rapporterats att rotkvaliteten hos mikroplantor av valnöt är bättre när rötterna bildas ex vitro under dimma än in vitro i ett gelerat medium (Leslie et al., 2010).
Figur 6. (a) och (b) In vitro rotade mikroförökade körsbärsplantor redo för utplantering i ett växthusmedium av sphagnumtorv innan de placeras under hög relativ fuktighet för acklimatisering. (c) Körsbärsplantor som planteras som det första steget i acklimatisering i växthus. (d) Valnötsplantlar som planteras i en platta innan de placeras under hög relativ fuktighet i ett växthus.
Ex vitro rooting kan vara en förbättring av in vitro rooting. Även om in vitro-mikroskott av Gardenia jasminoides rotade på 10 dagar, jämfört med 14 för ex vitro-mikroskott, överlevde alla ex vitro-rotade mikroskott acklimatisering jämfört med 80 % överlevnad för in vitro-rotade mikroskott (Hatzilazarou et al., 2006). Sämre överlevnad av mikroskott med in vitro-rötter jämfört med ex vitro-rötter rapporterades också för valnöt (Leslie et al., 2010).
Det kan vara nödvändigt att behandla mikroskott med auxin innan de planteras i rotningsmedium för ex vitro-rötter. Pistage-mikroskott som behandlats med 2 % IBA i talk har rotat sig ex vitro till 79 % jämfört med 48 % för kontrollerna (Benmahioul et al., 2012).
Förbättrad rötning ex vitro kan också erhållas med hjälp av auxin som appliceras i form av en vätskebädd som appliceras på den basala delen av mikroskotten. En 15 minuters puls i 250 µM IBA fick 90 % av trädslaget Melia azedarachs mikroskott att rota sig jämfört med ingen rötning på kontrollmikroskott (Husain och Anis, 2009). Ett 2 timmars dopp i en vattenlösning med 588 µM IBA fick 90 % av Malus zumi-mikroskott att rota sig jämfört med 20 % av kontrollerna (Xu et al., 2008).
Möjligen på grund av en återgång till juvenilitet kan en förlängning av den tid då man förökar sig in vitro öka rotbildningen av mikroskott. Leva och Petruccelli (2012) testade rotning upp till sju subkulturer och fann att rotningen var bäst efter den sjunde subkulturen.
Anläggningar, arten, leveransmetod, kundernas efterfrågan och ledningens preferenser dikterar alla hur mikroskott rotas. Arter som rotar sig mycket lätt eller rotar sig under skottförökningsfasen kan snabbt acklimatiseras till ex vitro-miljön. Det är de utmanande arterna som får särskild uppmärksamhet när det gäller belysning, auxinbehandling, rotning in vitro eller ex vitro och andra faktorer. De kloner som är svåra att rota kräver högre priser av kunderna eftersom rotning är ett hinder för effektiv produktion. Rötning kan förbättras om man ser det som en process i flera steg där man förvärvar kompetens, påbörjar rotbildning och därefter växer rötter. Alla dessa steg måste beaktas och åtgärdas, särskilt när det gäller de mer svårrotade klonerna.