Ammoniumsulfat Proteinutfällning: Nyckeln till saltning

Saltfällning kan vara ett mycket kraftfullt verktyg för att rena proteiner genom fällning. Ammoniumsulfat är vanligtvis det salt som väljs eftersom det är billigt, mycket lösligt i vatten och kan bli mycket mer hydrerat (interagerar med fler vattenmolekyler) än nästan alla andra joniska lösningsmedel. I praktiken tillsätts ammoniumsulfat antingen direkt som ett fast ämne eller som en (vanligtvis) mättad lösning för att fällas ut önskade proteiner.

Vid låga saltkoncentrationer (<0,15 M) tenderar tillsättning av mer salt i allmänhet att öka proteinernas löslighet eftersom jonerna skyddar proteinmolekylerna från andra molekylers laddningar; denna tendens kallas ”salting-in”. Vid en viss tidpunkt blir jonstyrkan för hög och börjar ha en negativ effekt på proteinernas löslighet, vilket kallas ”saltning”. Detta beror på att det lösta saltet konkurrerar med proteinerna om de knappa vattenmolekylerna, vilket ökar vattnets ytspänning och därför får proteinet att veckla sig hårdare. Den minskade proteinytan innebär färre protein-vatteninteraktioner vilket möjliggör fler hydrofoba interaktioner mellan proteinmolekylerna, vilket orsakar aggregering och därefter utfällning.

Proteiner i lösning kan också fraktioneras ut eftersom de fälls ut som en funktion av saltkoncentrationen. På detta sätt är det möjligt att rena specifika proteiner genom att tillsätta en viss mängd ammoniumsulfat för att fälla ut icke önskvärda proteiner, återvinna supernatanten och sedan tillsätta lite mer ammoniumsulfat för att fälla ut det önskade proteinet och sedan spara den pelletsen av det utfällda proteinet. Eftersom saltutfällning endast påverkar proteinernas löslighet och inte denaturerar dem kan den återvunna fraktionen förvaras i saltlösningen under längre perioder utan att man behöver oroa sig för bakteriell kontaminering eftersom den höga salthalten hämmar all mikrobiell tillväxt eller proteasaktivitet.

Då ammoniumsulfatfällning endast minskar proteinernas löslighet och inte denaturerar dem kan proteinerna koncentreras genom att avlägsna den återstående ammoniumsulfatlösningen varefter proteinpelletsen kan resolubiliseras i standardbuffertar eller en lägre koncentration av ammoniumsulfat. Hydrofob interaktionskromatografi eller gelfiltreringskromatografi kan sedan användas för att ytterligare rena proteinlösningen. Ammoniumsulfat kan också användas för att styra vissa proteiner som vecklats ut av denatureringsmedel som t.ex. urea tillbaka till sina korrekta nativa konformationer genom att gradvis öka koncentrationen av ammoniumsulfat.

Det finns några bästa metoder som bör beaktas när man arbetar med ammoniumsulfat, t.ex.:

• Använd en mortel och en mortel för att bryta upp klumpar och på annat sätt mala upp ammoniumsulfatet för att underlätta addition och upplösning.
• Häll endast en liten mängd ammoniumsulfat åt gången, vänta tills det löser sig och rör försiktigt om för att undvika skumning.
• Använd en buffert som 50 mM HEPES eller Tris för att minimera den försurande karaktären hos ammoniumsulfat.
• Använd ammoniumsulfat av analytisk kvalitet eftersom lägre kvaliteter vanligtvis uppvisar tungmetallkontaminering.

Processen med saltutfällning har vissa nackdelar. För att salta ut proteiner krävs det att man i förväg känner till proteinets löslighet. Dessutom kan eventuella föroreningar som finns i det ursprungliga provet fortfarande finnas kvar i den fraktion som innehåller det intressanta proteinet; denna process koncentrerar proteinet men renar det inte. Dessutom kan det vara nödvändigt att avlägsna saltet från proteinprovet och därför krävs ytterligare behandling i form av antingen dialys eller kromatografi.

Relaterade blogginlägg

• Vilka tekniker för proteinutfällning används för koncentrering och rening?
• Plantproteinextraktion och tekniker för proteinutfällning