De fem bästa metoderna för primär antikroppsmärkning

I alla tillämpningar som använder antikroppar för signaldetektion (t.ex. Western Blotting, ELISA, immunohistokemi eller FACS) finns det två metoder för antikroppsmärkning: direkt och indirekt märkning. Standard Western Blotting använder indirekt märkning eftersom man använder en primär antikropp för att detektera målantigenet, följt av en sekundär antikropp till vilken en detektionsmolekyl är fäst.

I vissa situationer kan det vara bättre att hoppa över den sekundära antikroppen och alla tillhörande steg och direkt märka din primära antikropp. Fall som kräver direkt märkning av primära antikroppar är bl.a. följande:

• Det förekommer ospecifik bindning av sekundär antikropp
• Du använder icke-specifika antikroppar.standardorganismens primära antikroppar – i detta fall kan det vara svårt att hitta bra sekundära antikroppar
• Vid multiplexering med antikroppar som kommer från samma art
• Vid behov av att förkorta försökstiden genom att eliminera inkubering av sekundära antikroppar och tillhörande tvättsteg

Antikroppsparametrar

Du kan märka den valda antikroppen inte bara med fluorescerande färgämnen utan även med fluorescerande proteiner, enzymer och färgade partiklar. Alla dessa är vanligtvis bundna via en terminal lysingrupp, så du måste undvika aminhaltiga buffertar (t.ex. Tris) och molekyler genom alla steg. Annars kommer du mest att märka dina buffertmolekyler! Du bör också undvika det vanliga buffertkonserveringsmedlet natriumazid eftersom det stör märkningsreaktionen.

Antikroppen för märkning bör ha en koncentration på minst 0,5 mg/ml och vara >90 % ren. Ju mindre störande proteiner och molekyler som innehåller aminogrupper du har i ditt antikroppspreparat, desto effektivare blir märkningsreaktionen. Men även om din antikropp simmar i glycin och BSA kan du alltid avlägsna störande ämnen genom dialys. Du kan också förbättra din antikroppens renhet genom att låta den passera genom en A-proteinkolonn eller så kan du till och med förbereda din egen kolonn för affinitetsrening med ett lämpligt antigen.

Huvudsakliga interna antikroppsmärkningsmetoder

NHS-(Succinimidyl)-estermetoden

Denna metod är användbar för konjugering av antikroppar med allmänt tillgängliga fluorescerande färgämnen, såsom rhodaminderivat. Den utförs vanligtvis i en fosfatbuffert med efterföljande separation på kolonnen från det omärkta färgämnet. Den största nackdelen är att estrarna är instabila eftersom de är fuktkänsliga. Den märkta antikroppen bör användas omedelbart efter avslutad reaktion.

Isothiocyanatmetoden

Du kan använda denna metod för att framställa fluoresceinisothiocyanat (FITC), som är mycket populärt vid framställning av fluorescerande proteiner och antikroppar. Om du har arbetat med fluorescerande mikroskopi har du haft att göra med FITC. Isotiocyanatanaloger av olika standardfärgämnen finns också tillgängliga.

Isotiocyanat är stabilare än NHS, men det är svårare att tillverka och din märkningsreaktion kommer sannolikt att bli mindre effektiv med denna metod. Liksom med NHS bör överskottsfärgämnet avlägsnas efter reaktionen genom kromatografi.

Karbodiimidmetoden

Karbodiimidderivat omvandlar karboxylgrupper på proteiner till reaktiva intermediärer som kan reagera med lysiner. Den höga reaktiviteten hos karbodiimider innebär att de kan användas för att märka antikroppar med relativt inerta material, t.ex. magnetiska partiklar eller guldpartiklar. Den vanligaste karbodiimid som används är EDC. NHS tillsätts ibland till reaktionen för att underlätta bildandet av relativt stabila intermediärer.

Metoden är enkel, men i likhet med NHS är EDS hygroskopisk, så du måste använda din antikropp omedelbart efter märkning.

Två-tagg-metoden

Här märker du din antikropp med ett annat protein som tjänar som katalysator, till exempel HRP eller alkaliskt fosfatas. Eftersom båda molekylerna innehåller många aminogrupper skulle en direkt tvärbindning (som med NHS-metoden) leda till polymerer av samma molekyl. Därför skulle du utföra kopplingen i två separata steg. Du korslänkar antikroppen till molekyl X och katalysatorn till molekyl Y. Du måste välja X och Y noggrant eftersom de ska interagera för att bilda konjugatet. Du kan till exempel välja maleimid som X och en tiol som Y.

Men även om det resulterande konjugatet kommer att vara stabilare än vad du får med NHS-metoden kräver denna metod tre gånger så mycket arbete; separata märknings- och reningssteg för antikroppen, katalysatorn och den konjugerande reaktionen. Den goda nyheten är att du kan köpa förmärkt katalytisk molekyl och sedan märka din antikropp i enlighet med detta.

Periodatmetoden

Denna metod är användbar för generering av specifika HRP-antikroppskonjugat. Periodat aktiverar HRP genom att skapa aldehydmolekyler som interagerar med lysinrester. Själva HRP har endast ett fåtal lysinrester, så enzympolymerisering är inget större problem. Bindningarna mellan HRP och antikroppen är reversibla om de inte stabiliseras genom tillsats av natriumcyanohydrid.

Detta var min genomgång av de bästa hemmagjorda metoderna för märkning av antikroppar. Det finns många kommersiella kit på marknaden med liknande underliggande kemi som kan göra ditt liv mycket enklare. Om ditt labb har pengar.

Har du en annan antikroppsmärkningsmetod som du vill dela med dig av till oss? Hör av dig genom att skriva i kommentarsfältet.

Litteratur:

Meyer JP, Adumeau P, Lewis JS, Zeglis BM. Klicka kemi och radiokemi: The First 10 Years. Bioconjug Chem. (2016) 27(12):2791-2807. doi: 10.1021/acs.bioconjchem.6b00561. Epub 2016 Nov 22.

.