Proximity-Labeling MS (APEX-MS)

För detta tillvägagångssätt fusioneras det aktuella proteinet till ett peroxidas (askorbinsyraperoxidas; APEX). Vid behandling med H2O2 omvandlar APEX exogent tillförd biotinfenol till biotinfenoxylradikaler, vilket resulterar i en kovalent märkning av protein i en radie på 20 nm. Därefter anrikas de biotinylerade proteinerna med hjälp av Steptavidin. Denna teknik gör det för första gången möjligt att ta ”ögonblicksbilder” av lokala proteinmiljöer vid en viss tidpunkt och att fånga övergående proteininteraktioner. Metoder för närhetsbaserad märkning har utvecklats snabbt under de senaste åren och har visat sig ge kompletterande resultat till traditionella affinitetsbaserade reningsmetoder (AP-MS) och har därmed potential att öppna helt nya forskningsvägar och ge nya insikter om proteinfunktioner.

APEX har använts för att fånga upp hela organellproteom med hög tidsmässig upplösning, men dess bredd av märkning anses i allmänhet utesluta den högre rumsliga upplösning som krävs för att förhöra specifika proteinnätverk. Vi har nyligen tillhandahållit en lösning på detta problem genom att kombinera kvantitativ proteomik med ett system av rumsliga referenser. Denna nya metod gör det möjligt för oss att identifiera kända bindningspartners, liksom tidigare oidentifierade nätverkskomponenter, vilket nyligen visades i en principbevisstudie där proteiner som engageras av G-proteinkopplade receptorer förhörs när de dynamiskt signalerar och trafikerar som svar på ligandinducerad aktivering.