Běžně používané testy apoptózy ve výzkumu apoptózy

Dotaz:

Jaké jsou nejčastěji používané testy apoptózy?

Protein Man říká:

Výzkum apoptózy vyžaduje použití široké škály testů apoptózy, protože samotný proces je poměrně složitý. Kromě toho neexistuje jediný parametr, který by definoval buněčnou smrt ve všech systémech, takže byste při svém výzkumu měli používat několik přístupů.

Hlavní typy apoptosis assays

Existuje pět různých typů apoptosis assays, které se v současné době používají při výzkumu apoptosis. Patří sem kaspázové testy, testy fragmentace DNA, testy propustnosti buněk a mitochondriální testy. Kromě toho existuje také typ testu, který lze použít k usnadnění analýzy signálních drah apoptózy.

Testy kaspázy. Přítomnost enzymů kaspáz v jakémkoli vzorku je jistým ukazatelem, že probíhají komplexní biochemické děje spojené s apoptózou. Testy kaspáz jako takové lze použít k detekci apoptózy v buněčných populacích v jejích nejranějších fázích. Tyto testy běžně používají specifické substráty, které kaspázy štěpí a uvolňují kolorimetrické nebo fluorometrické substráty.

Testy fragmentace DNA. Apoptóza a štěpení DNA jdou ruku v ruce, takže můžete určit rozsah apoptózy měřením fragmentů DNA přítomných ve vzorku. Většina výzkumníků k tomuto účelu používá žebříčkovou analýzu apoptopické DNA, kvantifikaci ELISA a testy TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling).

Testy buněčné propustnosti. Střední stadium apoptózy lze stanovit pomocí testů buněčné propustnosti. Jak pravděpodobně víte, zdravé buňky mají tuhé plazmatické membrány, zatímco mrtvé buňky mají vysoce propustné buněčné membrány. Díky vysoce porušeným membránám mohou fluorescenční barviva snadno procházet apoptopickými buňkami. Když se tak stane, budete pozorovat charakteristickou fluorescenci nebo barvicí vzor, který indikuje přítomnost apoptopické buněčné populace ve vašem vzorku.

Zvýšení propustnosti buněk má také za následek ztrátu cytosolických proteinů z buňky. Laktátdehydrogenáza (LDH) je rozpustný cytosolický enzym, který se uvolňuje do kultivačního média po ztrátě integrity membrány v důsledku apoptózy nebo nekrózy. Aktivitu LDH lze proto použít jako indikátor integrity buněčné membrány a slouží jako obecný prostředek k posouzení cytotoxicity způsobené chemickými sloučeninami nebo toxickými faktory prostředí. Pro kvantifikaci uvolněné LDH existuje několik testů.

Mitochondriální testy. Mitochondriální testy mohou pomoci určit rané stadium apoptózy, protože používají kationtové barvivo, které vydává odlišnou fluorescenci při použití v populaci zdravých buněk a v populaci apoptopických buněk.

Znalost toho, které testy apoptózy použít a kdy je použít, vám může výrazně pomoci při výzkumu, takže je raději začněte znát nazpaměť.