Mikropropagace Anthurium spp.

2.1. Tkáňové kultury Anthurium

Metody vitropropagace mají oproti konvenčnímu množení několik výhod, jako je flexibilní nastavení faktorů ovlivňujících regeneraci, jako je typ explantátu, hladina živin a regulátorů růstu rostlin a podmínky prostředí, produkce klonů v požadované míře, kontinuální produkce během sezónních změn pomocí metod tkáňových kultur také zvyšují rychlost množení rostlin .

Typ explantátu

Úspěch tkáňové kultury souvisí se správným výběrem explantátů. Nejčastěji používanými typy kultur při mikropropagaci rostlin jsou výhonky nebo špičky výhonků a uzlové kultury. Explantáty z vrcholů výhonů a uzlových segmentů stonků jsou vhodné pro zvýšené axilární větvení. Úspěšně bylo využito mikropropagace anturie z axilárních pupenů, špiček výhonů, explantátů z lamina, uzlu, řapíku a mikrořízků . Z těchto částí rostliny jsou listy nejpoužívanějším zdrojem explantátů ve vitrokultuře Anthurium.

Genotyp Anthuriumhraje důležitou roli ve vitropropagaci. Studie ukázaly, že různé genotypy mají různou odezvu na stejné kultivační podmínky. Z tohoto důvodu je nutné stanovit vhodný postup pro jednotlivé odrůdy Anthurium, které lze přizpůsobit komerční produkci .

Pro rostliny je důležitý výběr typu explantátu pro indukci kalogeneze a orgonogeneze. Ve studiích přímé a nepřímé orgonogeneze je pro úspěch kultury důležité použití mladých listových explantátů. Martin et al. pozorovali vyšší počet výhonů u hnědých explantátů mladých listů než u mladých zelených listů. Viégas et al. rovněž poukázali na důležitost použití nových hnědých listů pro indukci kalusu. Bejoy et al. uvedli, že explantáty vyříznuté ze světle zelených listů vykazovaly lepší vývoj kalusu než světle hnědé listy. Atak a Çelik rovněž použili mladé hnědé a zelené listy Anthurium andreanumpro hodnocení účinnosti tvorby kalusu. Dosáhli zkrácení doby tvorby kalusu použitím explantátů z hnědých listů a indukovali o 50 % vyšší procento tvorby kalusu než při použití zelených listů.

Založení aseptické kultury

Druhým důležitým krokem při mikropropagaci je získání aseptické kultury rostlinného materiálu. Aseptické kultivační systémy účinně eliminují bakteriální, houbové a hmyzí kontaminanty. Sterilizační protokoly použité pro různé zdroje rostlin Anthuriumexplant byly uvedeny v tabulce 1. NaOCl je hlavním dezinfekčním materiálem používaným při vytváření aseptických kultivačních podmínek Anthurium. NaOCl byl použit v koncentracích lišících se od 1 % do 5 % . Doby inkubace explantátů v chloridu sodném vykazovaly rozdíly vzhledem k jeho koncentracím. Je také třeba použít další dezinfekční roztoky k likvidaci houbových a bakteriálních kontaminantů. K tomuto účelu se účinně používají benomyl , cetrimit, gentamicin a streptomycin sulfát .

Kultivační médium

Kultivační médium ovlivňuje účinnost množení při použití rostlinných tkáňových kultur. Ke stimulaci zdravého růstu se používají organické sloučeniny, vitaminy a regulátory růstu rostlin. Rychlost růstu tkání a morfogenetické reakce jsou vysoce ovlivněny vlastnostmi obsažených živin.

Existuje několik základních médií, například Chu , Gamborgův B5 , Murashige a Skoog , Murashige a Tucker a Nitsch a Nitsch . Tato média se úspěšně používají pro zakládání tkáňových kultur různých explantátů různých rostlin .

Ve studiích rostlinných tkáňových kultur se pro vývoj účinných protokolů používají různé kombinace každého média založené na různých koncentracích makro a mikroživin. Rychlé a účinné protokoly tkáňových kultur jsou důležité pro mikropropagaci Anthuriumas stejně jako u jiných rostlin.

Úspěch rostlinných tkáňových kultur závisí na složení použitého média. Různé kombinace makroživin jako dusík, draslík, vápník, fosfor, hořčík a síra a mikroživin jako železo, nikl, chlor, mangan, zinek, bór, měď a molybden mění charakter média.

Každý rostlinný druh má své vlastní složení média nebo by mělo být vylepšeno pro dosažení lepších výsledků. Úpravy lze provést v oblasti makro- a mikroživin, obsahu cukru, regulátorů růstu rostlin, vitaminů a dalších dusíkatých doplňků.

MS média s určitými modifikacemi byla často používána v tkáňové kultuře Anthurium. Rozdíly způsobené použitím různých koncentrací regulátorů růstu rostlin v kombinaci s MS organickými látkami se používají k získání požadovaných tkání .

Dusík je základní makroživinou v životě rostlin. Je důležitou složkou bílkovin a nukleových kyselin. Hlavním zdrojem dusíku jsou dusičnany. NO3- se po příjmu redukuje na amonium. Rostliny mají schopnost využívat redukovanou formu dusíku pro svůj metabolismus. Příjem dusičnanů probíhá účinně při kyselém pH. Po příjmu dusičnanů se však prostředí stává méně kyselým. Při příjmu amoniaku se médium stává kyselejším. pH kultivačního média pro rostliny je důležité, protože v pufrovaném médiu existence obou iontů ovlivňuje účinný příjem dusíku. Forma a množství dusíku v médiu mají významný vliv na růst a diferenciaci buněk. kontrola pH v médiu není jediným důvodem použití obou iontů, nadměrné množství amonných iontů je pro rostliny toxické. Média obsahující vysoké množství NH4+ také inhibují syntézu chlorofylu .

Je známo, že růst kořenů je indukován NO3- a redukován NH4+. Morfogeneze je však řízena celkovým množstvím dusíku v médiu a potřebuje jak NO3-, tak NH4+. Kvůli použití optimálního NH4+: NO3- má klíčovou roli v morfogenezi, proto se rovnováha mezi NO3- a NH4+ u různých rostlin a různých druhů kultur liší. Z této situace vyplývá, že tento poměr by měl být specificky upraven pro každý rostlinný druh a pro různé účely. Změna poměru NO3- a NH4+ malými změnami ovlivňuje diferenciaci a růst.

MS média často používaná pro tkáňové kultury Anthurium a poměr NO3- a NH4+ je u tohoto média 66:34. Z tohoto důvodu se obecně modifikované MS médium používá při organogenezi Anthurium. Vědci studovali modifikace koncentrace dusičnanu amonného na médiu Anthurium. Hamidah et al. použili poloviční sílu MS makrozbytků s 2,5 mM dusičnanu amonného pro zásobní kultury in vitro. Zatímco Puchooa použil pro kalusovou kulturu sníženou koncentraci dusičnanu amonného 200 mg/l, pro regeneraci zvýšili množství na 720 mg/l. Dufour a Guérin použili pro hodnocení výsledků vývoje různé složení NO3 a NH4. Podle jejich výsledků vykazoval poměr 0,37 lepší růst a vývoj rostlin. Atak a Çelik dávali přednost použití poloviční síly MS solí s NH4NO3 sníženým na 250 mg/l pro regeneraci výhonů. Winarto a kol. zdokonalovali protokol pro indukci kalusu a regeneraci rostlin a médium NWT-3 obsahovalo 750 mg/l NH4NO3.

V kultivačních podmínkách má použití syntetických chemických látek s podobnou fyziologickou aktivitou jako rostlinné hormony schopnosti vyvolat požadovaný růst rostlin. Auxin a cytokininy jsou nejdůležitější hormony regulující růst a morfogenezi v rostlinných tkáňových kulturách. Jejich kombinované použití podporuje růst kalů, buněčných suspenzí, vývoj kořenů a výhonků a mají schopnost regulovat morfogenezi . Vedle přírodních látek existují syntetické auxiny a cytokininy. K indikaci tvorby kalusu z různých druhů explantátů kultivarů Anthurium byly použity různé kombinace a koncentrace rostlinných růstových regulátorů, jako je kyselina 2,4-dichlorfenoxyoctová , kyselina naftalen octová , benzylaminopurin a kinetin. V předběžných studiích je indukce a regenerace kalusu následovaná regenerací výhonů a kořenů hlavním krokem tkáňové kultury celých rostlin. Protože se jedná o významnou komerční rostlinu, je hlavním cílem vyvinout rychlý a účinnější protokol tkáňové kultury, který by zkrátil dobu pěstování tkáňové kultury Anthurium .

Jak je uvedeno v tabulce 2, často se používá kombinace 2,4-D a BA v kultivačních médiích k indukci iniciace kalusu z listových explantátů u různých odrůd Anthurium. Také přidání BAP a 2-iP do kalusového média bylo hodnoceno různými výzkumníky. Koncentrace 2,4-D používané v kalusovém médiu se pohybují v rozmezí od 0,08 mg/l do 1 mg/l 2,4-D. Koncentrace BA se mění v rozmezí 0.1 mg/l a 1 mg/l.

Mikroplodiny vyžadují vyvinutý kořenový systém, aby odolaly podmínkám vnějšího prostředí. Zakořeňování výhonů probíhá in vitro. Proto je stanovení vhodného typu a množství auxinu v médiu potřebné pro podporu zakořeňování .

Pro podporu růstu kořenů se do média přidává aktivní uhlí. AC se skládá z uhlíku a často se používá v rostlinných tkáňových kulturách k absorpci plynů a rozpuštěných pevných látek. Není regulátorem růstu, ale má schopnost měnit složení média .

Na typu kultury závisí několik výhodných použití dřevěného uhlí. Jsou to adsorpce vylučovaných sloučenin z kulturních tkání, snížení fenolových oxidací, změny pH média pro optimalizaci morfogeneze, prevence nežádoucího růstu kalusu, simulace půdních podmínek díky schopnosti podporovat tvorbu kořenů, schopnost využití při produkci sekundárních rostlinných produktů v podmínkách kultury .

Nejdůležitějším účinkem použití AC do média je důsledné snížení koncentrací regulátorů růstu rostlin a dalších organických doplňků. AC vykazuje větší adsorpční schopnost pro fenolické látky běžně produkované poraněnými pletivy, rostlinné hormony jako IAA, NAA, IBA, BA, kinetin, zeatin a další hormony . Adsorpční vlastnost AC se mění s čistotou, pH a hustotou . Semenáčky Anthurium množené Atakem a Çelikem byly zakořeněny v médiu obsahujícím AC a uvedeny na obrázku 1.

.