Pět nejlepších metod značení primárních protilátek

V každé aplikaci, která používá protilátky pro detekci signálu (např. Western blotting, ELISA, imunohistochemie nebo FACS), existují dva přístupy ke značení protilátek: přímé a nepřímé značení. Standardní Western blotting používá nepřímé značení, protože k detekci cílového antigenu se používá primární protilátka, po níž následuje sekundární protilátka, ke které je připojena detekční molekula.

V některých situacích může být lepší vynechat sekundární protilátku a všechny související kroky a označit primární protilátku přímo. Mezi případy, které volají po přímém značení primární protilátky, patří např:

• Dochází k nespecifické vazbě sekundární protilátky
• Používáte nespecifickou protilátku
• .standardní primární protilátky proti organismům – v tomto případě může být obtížné najít dobré sekundární protilátky
• Při multiplexování s protilátkami, které pocházejí ze stejného druhu
• Pokud potřebujete zkrátit dobu experimentu eliminací inkubace sekundárních protilátek a souvisejících promývacích kroků

Parametry protilátek

Můžete vybranou protilátku značit nejen fluorescenčními barvivy, ale také fluorescenčními proteiny, enzymy a barevnými částicemi. Všechny tyto látky jsou obvykle připojeny přes terminální lysinovou skupinu, takže se musíte ve všech krocích vyhnout pufrům a molekulám obsahujícím aminy (například Tris). V opačném případě budete většinou označovat molekuly pufrů! Měli byste se také vyhnout běžnému konzervačnímu činidlu azidu sodnému v pufrech, protože bude zasahovat do reakce značení.

Protilátka pro značení by měla být v koncentraci nejméně 0,5 mg/ml a >90% čistá. Čím méně interferujících proteinů a molekul obsahujících aminoskupiny budete mít v přípravku protilátek, tím účinnější bude reakce značení. Ale i když vaše protilátka plave v glycinu a BSA, interferující látky můžete vždy odstranit dialýzou. Čistotu své protilátky můžete také zlepšit průchodem přes A-proteinovou kolonu nebo si dokonce můžete připravit vlastní afinitní purifikační kolonu s vhodným antigenem.

Hlavní vlastní metody značení protilátek

Metoda NHS (sukcinimidyl) esterů

Tato metoda je užitečná pro konjugaci protilátek s široce dostupnými fluorescenčními barvivy, jako jsou deriváty rhodaminu. Obvykle se provádí ve fosfátovém pufru s následnou separací na koloně od neznačeného barviva. Hlavní nevýhodou je, že estery jsou nestabilní, protože jsou citlivé na vlhkost. Značená protilátka by měla být použita ihned po ukončení reakce.

Izothiokyanátová metoda

Tuto metodu můžete použít k výrobě fluorescein-izothiokyanátu (FITC), který je velmi oblíbený při přípravě fluorescenčních proteinů a protilátek. Pokud jste pracovali s fluorescenční mikroskopií, měli jste co do činění s FITC. K dispozici jsou také izothiokyanátové analogy různých standardních barviv.

Izothiokyanát je stabilnější než NHS, ale jeho výroba je obtížnější a vaše značkovací reakce bude při této metodě pravděpodobně méně účinná. Stejně jako u NHS je třeba přebytečné barvivo po reakci odstranit chromatografií.

Karbodiimidová metoda

Sloučeniny odvozené od karbodiimidu převádějí karboxylové skupiny na proteinech na reaktivní meziprodukty, které mohou reagovat s lyziny. Vysoká reaktivita karbodiimidů znamená, že je lze použít ke značení protilátek relativně inertními materiály, jako jsou magnetické nebo zlaté částice. Nejčastěji používaným karbodiimidem je EDC. Někdy se do reakce přidává NHS, aby se podpořila tvorba relativně stabilních meziproduktů.

Metoda je jednoduchá, ale podobně jako NHS je EDS hygroskopický, takže protilátku budete muset použít ihned po značení.

Metoda dvou značek

Při ní značíte protilátku dalším proteinem, který slouží jako katalyzátor, například HRP nebo alkalickou fosfatázou. Protože obě molekuly obsahují četné aminoskupiny, vedlo by přímé zesíťování (jako u metody NHS) ke vzniku polymerů stejné molekuly. Proto byste spojování provedli ve dvou oddělených krocích. Protilátku zesíťujete s molekulou X a katalyzátor s molekulou Y. Musíte pečlivě zvolit X a Y, protože by měly interagovat za vzniku konjugátu. Můžete například zvolit maleimid jako X a thiol jako Y.

Ačkoli výsledný konjugát bude stabilnější než ten, který získáte metodou NHS, tato metoda bude vyžadovat třikrát více práce; samostatné kroky značení a čištění protilátky, katalyzátoru a konjugační reakce. Dobrou zprávou je, že si můžete koupit předem označenou katalytickou molekulu a podle ní pak označit protilátku.

Periodátová metoda

Tato metoda je užitečná pro generování specifických konjugátů HRP s protilátkou. Periodát aktivuje HRP vytvořením molekul aldehydu, které interagují s lysinovými zbytky. Samotná HRP má pouze několik lysinových zbytků, takže polymerace enzymu nepředstavuje významný problém. Vazby mezi HRP a protilátkou jsou vratné, pokud nejsou stabilizovány přidáním kyanohydridu sodného.

To byl můj přehled nejlepších domácích metod značení protilátek. Na trhu je mnoho komerčních souprav s podobnou základní chemií, které vám mohou značně usnadnit život. Pokud na to vaše laboratoř má peníze.

Máte jinou metodu značení protilátek, o kterou byste se s námi chtěli podělit? Napište nám do komentářů.

Literatura:

Meyer JP, Adumeau P, Lewis JS, Zeglis BM. Kliková chemie a radiochemie: The First 10 Years (Prvních 10 let). Bioconjug Chem. (2016) 27(12):2791-2807. doi: 10.1021/acs.bioconjchem.6b00561. Epub 2016 Nov 22.

.