Srážení bílkovin síranem amonným:

Srážení solí může být velmi účinným nástrojem pro čištění proteinů srážením. Obvykle se jako sůl volí síran amonný, protože je levný, velmi dobře rozpustný ve vodě a dokáže se mnohem více hydratovat (interaguje s větším počtem molekul vody) než téměř jakékoli jiné iontové rozpouštědlo. V praxi se síran amonný přidává buď přímo jako pevná látka, nebo se přidává jako (obvykle) nasycený roztok k vysrážení požadovaných proteinů.

Při nízkých koncentracích soli (<0,15M) má přídavek většího množství soli obecně tendenci zvyšovat rozpustnost proteinů, protože ionty chrání molekuly proteinů před náboji jiných molekul; tento trend se označuje jako „zasolování“. V určitém okamžiku se iontová síla stane příliš vysokou a začne mít negativní vliv na rozpustnost bílkovin, což se označuje jako „salting-out“. K tomu dochází proto, že rozpuštěná sůl soutěží s bílkovinami o vzácné molekuly vody, zvyšuje povrchové napětí vody, a proto způsobuje těsnější skládání bílkovin. Zmenšení povrchu bílkovin znamená méně interakcí mezi bílkovinami a vodou, což umožňuje více hydrofobních interakcí mezi molekulami bílkovin, což způsobuje agregaci a následně precipitaci.

Bílkoviny v roztoku mohou být také frakcionovány, protože se vysrážejí v závislosti na koncentraci soli. Tímto způsobem je možné purifikovat specifické proteiny přidáním určitého množství síranu amonného k vysrážení nežádoucích proteinů, obnovením supernatantu a následným přidáním o něco většího množství síranu amonného k vysrážení požadovaného proteinu a následným uložením této pelety vysráženého proteinu. Vzhledem k tomu, že srážení solí ovlivňuje pouze rozpustnost proteinů a nedenaturuje je, lze získanou frakci uchovávat v roztoku soli po delší dobu, aniž by bylo nutné se obávat bakteriální kontaminace, protože vysoký obsah soli inhibuje jakýkoli mikrobiální růst nebo proteázovou aktivitu.

Protože srážení síranem amonným pouze snižuje rozpustnost proteinů a nedenaturuje je, mohou být proteiny koncentrovány odstraněním zbývajícího roztoku síranu amonného a poté může být proteinová peleta resolubilizována ve standardních pufrech nebo nižší koncentraci síranu amonného. K dalšímu přečištění roztoku proteinu lze pak použít hydrofobní interakční chromatografii nebo gelovou filtrační chromatografii. Síran amonný lze také použít k tomu, aby se některé proteiny rozložené denaturačními činidly, jako je močovina, vrátily do správné nativní konformace postupným zvyšováním koncentrace síranu amonného.

Při práci se síranem amonným je třeba zvážit některé osvědčené postupy, například:

• Použijte hmoždíř a pěchovadlo k rozbití shluků a jinak rozmělněte síran amonný, aby se usnadnilo přidávání a rozpouštění.
• Přidávejte vždy jen malé množství síranu amonného, počkejte, až se rozpustí, a jemně míchejte, abyste zabránili tvorbě pěny.
• Používejte pufr, jako je 50 mM HEPES nebo Tris, abyste minimalizovali okyselující charakter síranu amonného.
• Používejte analytický síran amonný, protože nižší třídy obvykle vykazují kontaminaci těžkými kovy.

Proces srážení solí má určité nevýhody. Vysolování proteinů vyžaduje předchozí znalost rozpustnosti proteinu. Kromě toho mohou být případné kontaminující látky přítomné ve výchozím vzorku stále přítomny ve frakci obsahující protein, který je předmětem zájmu; tento proces protein koncentruje, ale nepřečišťuje. Kromě toho může být nutné odstranit ze vzorku proteinu sůl, a proto bude nutné další zpracování buď formou dialýzy, nebo chromatografie.

Související příspěvky na blogu

• Jaké techniky srážení proteinů se používají ke koncentraci a čištění
• Techniky extrakce a srážení proteinů

.