Zlepšení fermentace L-arabinózy modifikací metabolické dráhy a transportu v Saccharomyces cerevisiae

Abstrakt

Dráha využití L-arabinózy byla vytvořena v Saccharomyces cerevisiae expresí kodonově optimalizovaných genů araA, araB a araD z Lactobacillus plantarum. Po nadměrné expresi genů TAL1, TKL1, RPE1, RKI1 a GAL2 a adaptivní evoluci se utilizace L-arabinózy rekombinantního kmene stala účinnou. Výsledný kmen vykazoval maximální specifickou rychlost růstu 0,075 h-1, maximální specifickou rychlost spotřeby L-arabinózy 0,61 g h-1 g-1 hmotnosti suchých buněk a slibný výtěžek ethanolu 0,43 g-1 z fermentace L-arabinózy.

1. Úvod

V zájmu snížení závislosti na fosilních palivech byla celosvětová produkce bioetanolu zvýšena z ~45 milionů litrů v roce 2005 na ~113 miliard litrů v roce 2012 . Budoucí velkovýroba palivového etanolu bude s největší pravděpodobností založena na hojných lignocelulózových materiálech namísto cukru a obilí, které jsou potravou pro lidi a zvířata . Nákladově efektivní výroba palivového etanolu z lignocelulózových materiálů vyžaduje plné využití surovin. Jedním z cílů výroby bioethanolu je vybavit fermentační mikroorganismus schopností přeměnit všechny cukry v lignocelulózových materiálech . Z lignocelulózových materiálů lze získat přibližně 3-15 % L-arabinózové složky . Proto je nutné zkonstruovat mikroorganismus fermentující L-arabinózu, aby se zvýšilo využití tohoto cukru .

U hub a bakterií existují dva typy metabolických drah L-arabinózy. Aldose reduktasa (AR), L-arabitol-4-dehydrogenasa (LAD), L-xylulose reduktasa (LXR) a D-xylitol dehydrogenasa (XDH) tvoří metabolickou dráhu L-arabinosy u hub. Reakce katalyzovaná AR a LXR je spojena s oxidací NADPH na NADP+ a LAD a XDH používají NAD+ jako kofaktor . Vzniklá xylulosa je fosforylována a vstupuje do pentózo-fosfátové dráhy (PPP). Bakteriální metabolická dráha L-arabinózy je nezávislá na kofaktoru a skládá se z L-arabinózy isomerázy (AraA), L-ribulokinázy (AraB) a L-ribulóza-5-fosfát 4-epimerázy (AraD). Vzniklý D-xylulosa-5-fosfát vstupuje do PPP . Obě metabolické dráhy L-arabinózy byly stanoveny u Saccharomyces cerevisiae, což je tradiční mikroorganismus produkující ethanol s vynikající schopností kvašení cukrů a tolerancí k drsnému prostředí, ale nedokáže fermentovat L-arabinózu . Není překvapivé, že u rekombinantního kmene S. cerevisiae obsahujícího houbovou metabolickou dráhu L-arabinózy dochází k redoxní nerovnováze. Výtěžek vedlejšího produktu L-arabitolu byl až 0,48 g g-1 pentosového cukru spotřebovaného při kofermentaci D-xylosy a L-arabinosy, ačkoli kmen exprimující NADH preferoval AR a LXR, aby snížil redoxní nerovnováhu .

Ve srovnání s houbovou metabolickou dráhou L-arabinosy je bakteriální dráha jednodušší a nezávislá na kofaktorech. Avšak kvůli nedostatku účinných testů aktivity enzymů zapojených do bakteriální metabolické dráhy L-arabinózy nebyla optimalizace této dráhy v S. cerevisiae jednoduchá. Kmen S. cerevisiae exprimující geny araA, araB a araD Escherichia coli nemohl využít L-arabinózu. Avšak poté, co byl gen pro L-arabinózu u E. coli nahrazen genem araA klonovaným z Bacillus subtilis, mohl kmen po několika kolech adaptačního růstu růst a produkovat ethanol na L-arabinóze . Kromě toho bylo využití L-arabinózy dále zlepšeno změnou použití kodonů bakteriálních genů araA, araB a araD na preferované kvasinkové kodony . Geny pro metabolismus L-arabinózy u Lactobacillus plantarum odpovídaly použití kodonů S. cerevisiae více než dříve uváděné geny. Wisselink a kol. vnesli do S. cerevisiae více kopií araA a araD a jednu kopii araB L. plantarum. Po nadměrné expresi genů kódujících enzymy neoxidativní PPP a rozsáhlé adaptivní evoluci vykazoval výsledný kmen vysoký výtěžek ethanolu až 0,43 g-1 při anaerobním růstu na L-arabinose s vysokou rychlostí spotřeby arabinosy (0,70 g h-1 g-1 suché hmotnosti buněk (DCW)) . Analýza metabolomu, transkriptomu a metabolických toků vyvinutějšího kmene ukázala, že vyšší hladiny exprese izoenzymů galaktózového transportéru, transketolázy a transaldolázy prospívají růstu S. cerevisiae na L-arabinose .

V této práci byly unikátní kodonově optimalizované geny araA, araB a araD L. plantarum exprimovány v kmeni S. cerevisiae CEN.PK102-3A na různých úrovních. Dále byly v tomto rekombinantním kmeni nadměrně exprimovány geny TAL1, TKL1, RPE1 a RKI1, které se podílejí na PPP. Výsledný kmen byl postupně selektován na L-arabinózu za aerobních podmínek a za podmínek s omezeným obsahem kyslíku. Byl získán kmen s výrazně zvýšenou schopností využívat L-arabinózu. Byla zkoumána metabolická kapacita L-arabinózy u vyvinutých kmenů a kmene, který rovněž nadměrně exprimoval transportní gen GAL2. Byly diskutovány faktory ovlivňující účinnost metabolismu L-arabinózy.

2. Materiál a metody

2.1. Kmeny, které ovlivňují účinnost metabolismu L-arabinózy. Média a podmínky kultivace

Pro kultivaci kvasinek bylo použito syntetické kompletní médium (SC) obsahující 1,7 g L-1 kvasinkové dusíkaté báze (YNB, Sangon, Čína) a 5 g L-1 síranu amonného (Sangon, Čína) s dalšími zdroji uhlíku glukózou (Sangon, Čína) nebo L-arabinózou (Sinopharm, Čína). Kompletní doplňková směs, 0,77 g L-1 CSM-URA nebo 0,67 g L-1 CSM-LEU-URA (MP Biomedicals, Solon, OH), byla v případě potřeby přidána k udržení požadovaných plazmidů s auxotrofní selekcí. Pro kmeny s markerem KanMX4 bylo do média přidáno 200 g ml-1 antibiotika G418 sulfát (Promega, Madison, WI, USA). Všechny kvasinky byly kultivovány při 30 °C.

2.2. Analýza indexu kodonové adaptace

Index kodonové adaptace (CAI) se používá k ilustraci preference používání kodonů u konkrétních druhů . Pro analýzu CAI byl použit CODONW (http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/MobylePortal/portal.py?form=codonw).

2.3. Konstrukce plazmidu a kmene

Pro subklonování byla použita E. coli DH5. Kmeny S. cerevisiae a plazmidy použité v této studii jsou uvedeny v tabulce 1. Primery použité v této studii jsou uvedeny v tabulce 2.

Jedinečné kodonově optimalizované geny araA, araB a araD kódující L-arabinózovou izomerázu (GenBank: CCC80517.1), L-ribulokinázu (GenBank: CCC80519.1) a L-ribulóza-5-fosfát-4-epimerázu (GenBank: CCC80518.1) z L. Plantarum byly uměle syntetizovány a ligovány mezi promotorem HXT7 a sekvencí terminátoru PGK1 plazmidu pHX, který byl vytvořen záměnou PGK1p plazmidu YEp24-PGKp za HXT7p, obsahující místa pro restrikční enzymy Kpn I a Sma I. Fragment HXT7p-araD-PGK1t byl amplifikován pomocí PCR s koncovými místy pro restrikční enzymy Hind III a Bln I a poté vložen do míst Hind III a Nhe I plazmidu YIp5, čímž vznikl plazmid YIp5-araD. Fragment HXT7p-araA-PGK1t obsahující terminální místa Bgl II a Sal I byl vložen do míst BamH I a Sal I plazmidu YIp5-araD, čímž vznikl plazmid YIp5-araAD. Fragment HXT7p-araB-PGK1t s místy Eag I a Stu I byl vložen do míst Eag I a Stu I plazmidu YIp5-araAD, čímž vznikl plazmid YIp5-ara (obrázek 1 a)). Promotorový fragment TEF1 (s koncovými místy pro Hind III a Sal I) a terminátorový fragment PGK1 (s koncovými místy pro BamH I a Hind III) byly klonovány z plazmidů pJFE3 a pYMIKP . Tyto dva fragmenty byly ligovány a vloženy do plazmidu pYX242 za účelem vytvoření vektoru pYX242-WS se dvěma místy, která lze použít k expresi genů. Poté byl mezi místa Sal I a Sac I tohoto vektoru vložen gen araA pod kontrolou promotoru TEF1 a terminátoru PloyA pro jeho expresi a výsledný plazmid byl pojmenován pYX2422-TEF1araA (obrázek 1b). Plazmid pYX2422-HXT7araA (obrázek 1(b)) byl zkonstruován s použitím fragmentu HXT7p, který nahradil fragment TEF1p plazmidu pYX2422-TEF1araA; spoji byly rozpoznávací sekvence BamH I a Sal I. Gen GAL2 byl klonován z chromozomální DNA CEN.PK102-3A a poté vložen do míst Xba I a Sal I plazmidu pJFE3, čímž vznikl plazmid pJFE3-GAL2. Fragment URA3 plazmidu pJFE3-GAL2 mezi místy Nde I a Apa I byl nahrazen genem KanMX4 klonovaným z pUG6 , čímž vznikl plazmid pJFE318-GAL2 (obrázek 1 c)).

(a)

(b)

(c)

.
(a)
(b)
(c)

Obrázek 1

Fyzikální mapy plazmidů a) YIp5-.ara, (b) pYX2422-TEF1araA/HXT7araA a (c) pJFE318-GAL2.

Transformace kvasinek byla provedena pomocí metody transformace octanem lithným . Plazmid YIp5-ara byl linearizován v místě Stu I a poté transformován do CEN.PK102-3A. Transformanti s geny araA, araB a araD integrovanými do chromozomálního genu URA3 byli selektováni na SC médiu obsahujícím CSM-URA a po potvrzení sekvenováním byl požadovaný transformant pojmenován BSW1A1. Do BSW1A1 byly transformovány plazmidy pYX242, pYX2422-HXT7araA a pYX2422-TEF1araA, čímž vznikly BSW1AY, BSW1A7 a BSW1AT. Linearizovaný pJPPP3, který obsahuje expresní rámce genů TAL1, TKL1, RPE1 a RKI1 , byl integrován do chromozomu BSW1AT v místě genu GRE3, čímž vznikl kmen BSW2AP. Kmen BSW2AP byl adaptován na 20 g L-1 L-arabinózy za aerobních podmínek a poté za podmínek s omezeným obsahem kyslíku. Po dosažení stacionární fáze byla zahájena nová várka přenesením kultury do čerstvého média s počáteční biomasou 0,15 g DCW L-1. Když se doba zdvojení kmene stabilizovala, byl z adaptovaných mutantů vybrán mutant BSW3AP na základě jeho vynikajícího růstu na L-arabinose. Plazmid pJFE318-GAL2 byl poté transformován do kmene BSW3AP, čímž vznikl kmen BSW3AG.

2.4. Kvantitativní PCR v reálném čase

Buňky byly kultivovány v SC médiu obsahujícím 20 g L-1 glukózy a odebrány, když OD600 kultur dosáhla 1. Celková RNA byla extrahována pomocí činidla TRIzol (Sangon, Čína). První vlákno cDNA bylo reverzně přepsáno z 1 g celkové RNA pomocí soupravy činidel PrimeScript RT s gDNA Eraser (Takara, Japonsko). Zředěné produkty cDNA byly použity pro kvantitativní PCR v reálném čase pomocí SYBR Green Real-time PCR Master Mix (TOYOBO, Japonsko) a LightCycle PCR System (Roche Molecular Biochemicals, Německo). Jako referenční gen pro normalizaci byl použit gen ACT1 kódující aktin. Údaje z PCR v reálném čase byly vypočteny podle metody . Primery pro tyto PCR byly uvedeny v tabulce 2.

2.5. Fermentace

Jediná kolonie byla kultivována přes noc v SC médiu obsahujícím 20 g L-1 glukózy. Vzorek noční kultury byl naředěn na počáteční OD600 0,5 v SC médiu obsahujícím 10 g L-1 glukózy a 10 g L-1 L-arabinózy. Po 10 hodinách kultivace byly buňky odebrány a použity k fermentaci. Všechny fermentace v třepačkách probíhaly při teplotě 30 °C, 200 ot.min-1 v 200 ml třepačkách obsahujících 40 ml média. Podmínky s omezeným obsahem kyslíku byly udržovány pomocí gumové zátky. Várkové fermentace za anaerobních podmínek byly prováděny ve fermentorech o objemu 1,4 l (Infors AG, Švýcarsko) s pracovním objemem 900 ml. Anaerobní podmínky byly udržovány přeplňováním dusíkem (0,1 l min-1); rychlost míchání byla 500 r min-1. Hodnota pH byla udržována na 5,0 automatickým čerpáním 1 mol L-1 NaOH a 1 mol L-1 H3PO4 . Počáteční biomasa byla 0,2 g DCW L-1. Zdrojem uhlíku v médiu SC plus CSM-LEU-URA bylo 20 g L-1 L-arabinózy; při fermentaci kmene BSW3AG bylo dodáno 200 g ml-1 G418. Hmotnost sušiny buněk vyvinutých kmenů a nevyvinutých kmenů byla vypočtena podle vzorce hmotnost sušiny (mg ml-1) = 0,266 × OD600 – 0,0762 a hmotnost sušiny (mg ml-1) = 0,2365 × OD600 + 0,1149, resp. Analýza produktů fermentace

K stanovení koncentrací cukrů a metabolitů byla použita vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) Prominence LC-20A (Shimadzu, Japonsko) vybavená detektorem indexu lomu RID-10A (Shimadzu, Japonsko). Iontově výměnná kolona Aminex HPX-87P (Bio-Rad, USA) byla použita k analýze L-arabinózy, arabitolu a ethanolu při 80 °C s mobilní fází z vody při průtoku 0,6 ml min-1. Iontově výměnná kolona Aminex HPX-87H (Bio-Rad, Hercules, USA) byla použita k analýze glycerolu a acetátu při 45 °C za použití mobilní fáze H2SO4 o koncentraci 5 mmol l-1 .

3. Výsledky

3.1. Exprese kodonově optimalizovaných genů zapojených do dráhy L-arabinózy v S. cerevisiae

Na základě aminokyselinové sekvence L-arabinóza isomerázy (GenBank přístupové číslo CCC80517.1), L-ribulokinázy (GenBank přístupové číslo CCC80519.1) a L-ribulosa-5-fosfát 4-epimerázy (GenBank přístupové číslo CCC80518.1) zaznamenané v National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), byly geny araA, araB a araD L. plantarum uměle syntetizovány pomocí preferovaných kodonů S. cerevisiae. CAI kodonově optimalizovaných araA, araB a araD byly 0,599, 0,580 a 0,646, což bylo více než u nativních sekvencí (0,324, 0,223 a 0,243, resp.).

Expresní kazety kodonově optimalizovaných araA, araB a araD byly integrovány do chromozomu kmene CEN.PK102-3A, čímž vznikl kmen BSW1A1. Kmen BSW1A1 však nemohl růst na L-arabinose, ačkoli všechny transkribované mRNA těchto genů byly detekovatelné. Poté bylo do BSW1A1 vneseno více kopií araA, nesených epizomálním plazmidem pYX242 a exprimovaných pod kontrolou promotorů HXT7 a TEF1. Hladiny transkripce araA ve výsledných kmenech BSW1A7 a BSW1AT byly -násobně a -násobně vyšší než v referenčním kmeni BSW1AY nesoucím pouze integrovanou exprimovanou araA. Kmeny BSW1A7 a BSW1AT byly aerobně inkubovány na L-arabinose a růst kmene BSW1AT byl pozorován po ~ 150 h, zatímco BSW1A7 nemohl růst ani při delší kultivaci.

3.2. Zlepšení využití L-arabinózy u S. cerevisiae pomocí inženýrství a evoluce

Geny TAL1, TKL1, RPE1 a RKI1 zapojené do neoxidativní pentózofosfátové dráhy byly nadměrně exprimovány v jedné kolonii izolované z kultury BSW1AT po 150 h integrací linearizovaného plazmidu pJPPP3 do chromozomu. Výsledný kmen BSW2AP se vyvíjel na L-arabinose. Po 9 přenosech v aerobních podmínkách a 12 přenosech v podmínkách s omezeným obsahem kyslíku se doba zdvojení kultury zkrátila z 22 h na 4,5 h. Mutanti byli prověřeni na L-arabinózových plotnách a byla vybrána velká kolonie, která byla pojmenována BSW3AP.

Hladiny transkripce genů v rekombinantních kmenech BSW1AT, BSW2AP a BSW3AP byly stanoveny pomocí kvantitativní PCR v reálném čase (obrázek 2). Hladina exprese araA u BSW2AP byla 2krát vyšší než u BSW1AT, zatímco hladiny exprese araB a araD u BSW2AP byly nižší. Tyto změny mohou být způsobeny mutacemi, ke kterým došlo během kultivace BSW1AT na L-arabinose. U vyvinutého kmene BSW3AP byly všechny tři geny exprimovány na vysoké úrovni. Úrovně exprese genů araA, araB a araD u kmene BSW3AP byly 4,1krát, 1,6krát a 2,5krát vyšší než u kmene BSW1AT.

Obrázek 2

Exprese araA (černé sloupce), araB (šedé sloupce) a araD (prázdné sloupce) kmenů BSW2AP a BSW3AP ve srovnání s kmenem BSW1AT. Změny hladin mRNA těchto genů jsou normalizovány na expresi genu ACT1. Testované kmeny byly kultivovány na 20 g L-1 glukózy. Uvedené hodnoty jsou získány ze tří nezávislých měření.

Využití L-arabinózy kmeny BSW1AT, BSW2AP a BSW3AP bylo porovnáváno v třepačkách za podmínek s omezeným obsahem kyslíku (obr. 3); počáteční OD600 byla 0,5. Kmeny BSW1AT, BSW2AP a BSW3AP byly porovnávány s kmeny BSW3AP. U kmene BSW1AT nebyl během 120 h pozorován žádný růst. Kmen BSW2AP rostl na L-arabinose s maximální specifickou rychlostí růstu () 0,011 h-1; za 120 h fermentace bylo spotřebováno 4,4 g L-1 L-arabinose a vyprodukováno 1,2 g L-1 ethanolu. Naproti tomu u vyvinutého kmene BSW3AP se zvýšila na 0,23 h-1. Po 120 h fermentace bylo spotřebováno 18,6 g L-1 L-arabinózy s maximální specifickou rychlostí spotřeby 0,7 g h-1 g-1 DCW; bylo vyrobeno 6,9 g L-1 ethanolu a výtěžek ethanolu byl 0,43 g-1; nahromadilo se pouze 0,13 g L-1 L-arabitolu.

(a)

(b)

(c)

(d)

.

(a)
(b)
(c)
(d)

Obrázek 3

Příloha Larabinózy kmenů v třepačkových baňkách. Růstová kapacita (a), spotřeba L-arabinózy (b), tvorba arabitolu (c) a tvorba ethanolu (d) kmeny BSW1AT (▲), BSW2AP (■) a BSW3AP (). Kmeny byly kultivovány ve 40 ml SC média s 20 g L-1 L-arabinózy při 30 °C, 200 r min-1 s počáteční OD600 0,5. Údaje jsou průměry ze tří nezávislých experimentů.

3,3. Nadměrná exprese GAL2 zlepšila anaerobní fermentaci L-arabinózy u vyvinutého kmene

Gen GAL2 pro permeázu galaktózy byl nadměrně exprimován u BSW3AP, čímž vznikl kmen BSW3AG. Byly studovány vlastnosti anaerobní fermentace L-arabinózy kmene BSW3AP a BSW3AG (obr. 4 a tab. 3) v bioreaktorech. Kmen BSW3AP rostl na L-arabinose s maximální specifickou rychlostí růstu 0,067 h-1. Maximální specifická rychlost spotřeby L-arabinózy byla 0,49 g h-1 g-1 DCW. Ethanol byl produkován při maximální specifické rychlosti 0,20 g h-1 g-1 DCW s výtěžkem 0,42 g-1. Nadměrná exprese GAL2 významně zlepšila fermentační kapacitu L-arabinózy. Maximální specifická rychlost růstu BSW3AG byla 0,075 h-1 , což bylo o 12 % rychleji než u BSW3AP. Specifická rychlost spotřeby L-arabinózy u BSW3AG byla 0,61 g h-1 g-1 DCW, což bylo o 24 % rychleji než u BSW3AP. Rychlost produkce ethanolu byla 0,27 g h-1 g-1 DCW a výtěžek ethanolu byl 0,43 g-1. BSW3AP i BSW3AG navíc produkovaly malé množství glycerolu (1,4 g L-1 pro oba kmeny) a téměř nedetekovatelné množství arabitolu a acetátu.

(a)

(b)

(a)
(b)

Obrázek 4

Anaerobní vsádková fermentace BSW3AP (a) a BSW3AG (b) na 20 g L-1 arabinózy. Hladiny (■), arabinózy (◆), ethanolu (▲), glycerolu () a acetátu (×). Fermentace probíhala ve fermentorech o objemu 1,4 l a pracovním objemu 900 ml. Anaerobní podmínky byly udržovány vháněním dusíku (0,1 l min-1); rychlost míchání byla 500 r min-1. Hodnota pH byla udržována na 5,0 automatickým čerpáním 1 mol L-1 NaOH a 1 mol L-1 H3PO4. Počáteční biomasa byla 0,2 g DCW L-1. Jako zdroj uhlíku v médiu SC plus CSM-LEU-URA byla použita 20 g L-1 L-arabinosa a při fermentaci kmene BSW3AG bylo dodáno 200 g ml-1 G418. Údaje jsou průměrem duplicitních stanovení.

4. Diskuse

Kompletní konverze cukrů je důležitá pro účinnou a nákladově efektivní výrobu palivového ethanolu z lignocelulózových materiálů. I malé zlepšení využití substrátu může výrazně snížit náklady na celý proces . L-arabinóza je důležitou složkou lignocelulózových materiálů. Exprese L-arabinózové dráhy L. plantarum se ukázala jako účinná při konstrukci L-arabinózy s využitím S. cerevisiae . Vzhledem k tomu, že kodonově optimalizované geny mohou vést ke zvýšené expresi proteinů , byly v této práci původní geny araA, araB a araD L. plantarum upraveny tak, aby odpovídaly použití kodonů S. cerevisiae, a poté integrovány do chromozomu kmene CEN.PK102-3A. Tento rekombinantní kmen však nemohl růst na L-arabinose. Do rekombinantního kmene bylo poté vneseno více kopií genu araA pod kontrolou promotorů HXT7 a TEF1. Když byly oba výsledné kmeny kultivovány na L-arabinose, růst byl pozorován pouze u kultur kmene exprimujícího araA pod kontrolou promotoru TEF1, u kterého byla úroveň transkripce araA 1,4krát vyšší než u kmene exprimujícího araA řízeného promotorem HXT7. Předpokládáme, že pouze pokud je úroveň transkripce araA vyšší než určitá úroveň, může dojít k růstu na L-arabinose. Naproti tomu do tohoto rekombinantního kmene byla vnesena pouze jedna kopie genů araB a araD a hladiny transkripce těchto genů byly nižší než u rodičovského kmene. Tyto jevy naznačují, že araB a araD jsou pro růst na L-arabinose méně důležité, protože pouze jedna kopie těchto genů umožňuje růst rekombinantního kmene na L-arabinose.

Adaptivní evoluce se ukázala být účinnou metodou pro zvýšení metabolické účinnosti kmenů . V této studii vykazuje evolvovaný kmen BSW3AP výrazně lepší schopnost metabolizovat L-arabinózu. Ke zlepšení mohla přispět zvýšená úroveň transkripce všech tří genů (araA, araB a araD). Ve srovnání s araA a araD byla úroveň exprese araB nižší. Becker a Boles uvedli, že mutant na L-arabinóze snížil aktivitu L-ribulokinázy exprimované araB. Relativně nižší exprese araB zabraňuje nadměrné spotřebě ATP, což by prospělo růstu kmene na L-arabinose.

L-arabinosa je novým zdrojem uhlíku pro S. cerevisiae. Příjem L-arabinózy u S. cerevisiae závisí především na nespecifickém transportu hexosovým transportérem Gal2p. Hxt9p a Hxt10p mohou také transportovat L-arabinózu, ale účinnost je velmi nízká . Bylo zjištěno, že nadměrná exprese GAL2 zlepšuje využití L-arabinózy . V této studii nadměrná exprese GAL2 výrazně zvýšila rychlost růstu a spotřebu L-arabinózy u našeho vyvinutého kmene BSW3AP. Tento výsledek naznačuje, že teoretický metabolický tok L-arabinózy je vyšší, než jsme zjistili u BSW3AP. Využití L-arabinózy u kmene BSW3AP bylo omezeno rychlostí její absorpce. Při nadměrné expresi GAL2 vedlo více Gal2p v plazmatické membráně ke zvýšenému příjmu L-arabinózy a následně k podpoře využití L-arabinózy. Náš výsledek dále potvrdil význam transportérů pro využití L-arabinózy; afinita Gal2p k L-arabinóze je však nízká a glukóza kompetitivně inhibovala jeho vazbu na L-arabinózu . Zlepšení účinnosti specifického transportéru L-arabinózy je třeba ještě provést.

5. Závěry

Pomocí několika kroků genetického inženýrství a adaptivní evoluce jsme získali kmen BSW3AG, který roste na L-arabinóze s a 0,075 h-1. Maximální specifická rychlost spotřeby L-arabinózy je 0,27 g h-1 g-1 DCW a maximální výtěžek ethanolu je 0,43 g-1 spotřebované L-arabinózy, což je 84,3 % teoretického množství. Vysoká úroveň exprese araA je obzvláště důležitá pro vytvoření účinné dráhy L-arabinózy v S. cerevisiae a pro zlepšení absorpční kapacity L-arabinózy u vyvinutých kmenů jsou nezbytné účinnější transportéry.

Konflikt zájmů

Autoři prohlašují, že nejsou ve střetu zájmů.

Poděkování

Tato práce byla podpořena Národním klíčovým programem základního výzkumu (2011CB707405), Národním programem výzkumu a vývoje špičkových technologií Číny v rámci grantu (2012AA022106), Čínskou národní nadací pro přírodní vědy (30970091, 31070096 a 31270151) a Mezinárodním programem spolupráce S&T Číny (2010DFA32560). Autoři děkují Dr. Peteru Kötterovi z Univerzity Johanna Wolfganga Goetha ve Frankfurtu za poskytnutí kmene CEN.PK102-3A.

.