Association of HPV genotypes with external anogenital warts: a cross sectional study
Study design and participants
Przeprowadzono badanie przekrojowe wykorzystujące próbę nieprobabilistyczną. Pacjenci uczęszczający do poradni dermatologicznych w Farwania Health District Area byli rekrutowani do badania sukcesywnie od listopada 2016 roku do maja 2017 roku. Immunokompetentni pacjenci z wcześniejszym rozpoznaniem klinicznym zewnętrznych brodawek anogenitalnych zaplanowanych do krioterapii lub leczenia laserowego zostali poproszeni o podpisanie formularza zgody po ustnym wyjaśnieniu dermatologa zachęcającego do udziału w badaniu. W czasie pobierania próbek, próbki brodawek pobierano do uniwersalnego podłoża transportowego (HealthLink Inc., Copan Italia S.p.A., Włochy) i przechowywano w temperaturze – 80°C. Zgodę etyczną uzyskano od Komisji Etycznej Centrum Nauk o Zdrowiu (numer: VDR/EC/2310) oraz Ministerstwa Zdrowia.
Demograficzne i kliniczne informacje zostały pobrane od każdego pacjenta, w tym: wiek (lata), płeć (mężczyzna, kobieta), narodowość (Kuwejtczyk, nie-Kuwejtczyk), liczbę brodawek (jedna, od dwóch do czterech, i co najmniej pięć), czas trwania obecności brodawek (< jeden miesiąc, od jednego do sześciu miesięcy, od siedmiu do 12 miesięcy, i więcej niż 12 miesięcy), rozmiar każdej brodawki (w centymetrach) (< jeden, jeden, między jednym a dwoma, więcej niż dwa), partnerzy mają brodawki (tak, nie), i czy brodawki były przedmiotem wcześniejszego leczenia (tak, nie). Żaden z uczestników nie otrzymał szczepienia przeciwko HPV, ponieważ szczepienie przeciwko HPV nie zostało jeszcze wdrożone w Kuwejcie, chociaż jego wdrożenie jest obecnie omawiane w Ministerstwie Zdrowia.
Ekstrakcja DNA i kontrole
Otrzymane próbki tkanek przechowywano w temperaturze – 80 °C. Ze względu na dużą liczbę otrzymanych próbek, wszystkie brodawki na jednego pacjenta były rozdrabniane razem i poddawane jednej izolacji DNA. Tkankę rozdrabniano sterylnymi nożyczkami i kleszczykami na płytce Petriego i ważono około 25-mg tkanki. Tkankę przemywano w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i przenoszono do probówek Eppendorfa o pojemności 1,5 ml. Genomowe DNA ekstrahowano z próbek tkanki przy użyciu zestawu QIAmp DNA Mini (Qiagen, USA) zgodnie z instrukcjami producenta.
Wektory HPV typu 2, HPV typu 1 i HPV typu 16 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) stosowano jako kontrole w eksperymentach PCR.
Real time PCR
Test real-time PCR przeprowadzono w celu przesiewowego wykrycia DNA HPV w brodawkach płciowych. Pięć mikrolitrów (5-μl) wyekstrahowanego DNA połączono z 12,5-μl 2X Syber Green master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) zawierającego ROX jako pasywne odniesienie oraz 10 pmol starterów forward i reverse (10-uM, opisane poniżej). Wszystkie zestawy primerów zostały zsyntetyzowane na zamówienie przez Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA. Mieszaninę uzupełniano do objętości 25 μl wodą wolną od nukleaz (Ambion, Austin, TX, USA). W celu zmniejszenia liczby wyników fałszywie pozytywnych lub negatywnych, próbki analizowano w duplikatach na płytce reakcyjnej z 96 dołkami optycznymi (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Pozytywne i negatywne kontrole zostały włączone do każdej partii amplifikacji. W celu ilościowego określenia HPV w próbkach, obok próbek wykonano pięcio- do dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenie DNA znanej kontroli pozytywnej. Amplifikację real-time PCR przeprowadzono w ABI 7500 real-time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
Atest real-time PCR przeprowadzono na trzech różnych płytkach. Pierwsza płytka została wykorzystana do określenia integralności docelowego DNA przez test PCR β-globiny, amplifikując docelowy fragment 268- bp, jak opisano wcześniej przez Lum i Le Marchand w 1998 roku . Sekwencja nukleotydów starterów β-globiny jest następująca: β-globina forward PCR primer: 5′-TGGTTTCTGATAGGCACTGACT-3′. Starter odwrotnego PCR dla β-globiny: 5′-AACAGCATCAGGAGTGACAGAT-3′.Amplifikacja PCR była inicjowana w 95 °C przez dziesięć minut i zakończona przez 45 cykli amplifikacji (denaturacja w 95 °C przez 15 s, wyżarzanie w 55 °C przez 45 s i przedłużanie w 65 °C przez jedną minutę).
Druga płytka została użyta do przesiewu na obecność infekcji HPV przy użyciu starterów MY11/GP6 z HPV L1 ORF . Sekwencje nukleotydów starterów MY11/GP6 są następujące: MY11 forward primer: 5′- GCM CAG GGW CAC AAY AAT GG -3′ i GP6 reverse primer: 5′- GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC-3′. Oczekiwana wielkość amplifikowanego fragmentu wynosi 185-bp. Amplifikację PCR rozpoczęto w 95 °C przez dziesięć minut i zakończono 45 cyklami amplifikacji (denaturacja w 95 °C przez 15 s, wyżarzanie w 45 °C przez 45 s i przedłużanie w 65 °C przez jedną minutę).
Trzecia płytka została wykorzystana do badań przesiewowych na obecność infekcji HPV przy użyciu starterów HVP2/B5 z HPV L1 ORF . Sekwencje nukleotydowe starterów HVP2/B5 są następujące: HVP2 forward primer: 5′- TCN MGN GGN CAN CCN YTN GG -3′; B5 reverse primer: 5′- AYN CCR TTR TTR TGN CCY TG -3′. Oczekiwany rozmiar amplifikowanego fragmentu wynosi 650-bp. Amplifikacja PCR została rozpoczęta w 95 °C przez dziesięć minut i zakończona przez 45 cykli amplifikacji (denaturacja w 95 °C przez 15 s, wyżarzanie w 50 °C przez 45 s i przedłużanie w 65 °C przez jedną minutę).
Widma fluorescencji zostały zarejestrowane podczas fazy elongacji każdego cyklu PCR. Oprogramowanie Sequence Detection Software (SDS v1.7) systemu ABI 7500 real-time PCR zostało użyte do wygenerowania krzywej amplifikacji dla każdej reakcji. Krzywa dysocjacji była generowana po każdej reakcji w celu rozróżnienia pomiędzy specyficznymi i niespecyficznymi amplikonami. Na podstawie krzywej amplifikacji do analizy wybrano wszystkie próbki, w których amplifikacja HPV rozpoczynała się w dowolnym cyklu, aż do cyklu numer 40 (z linią odcięcia 0,2). Tylko próbki z krzywą dysocjacji między 70 °C a 80 °C i z wartością pochodnej między 0,100-0,500 były uważane za HPV DNA pozytywne.
Sekwencjonowanie metodą Sangera
HPV DNA w brodawkach amplifikowano metodą nested PCR przed sekwencjonowaniem, przy użyciu AmpliTaq Gold Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) W pierwszym PCR stosowano startery HVP2/B5, a w drugim startery CN1F/CN1R, CN2F/CN2R, CN3F/CN3R i C4F/C4R. Pierwsza amplifikacja PCR została zapoczątkowana w temperaturze 95 °C przez dziesięć minut i zakończona 35 cyklami amplifikacji (denaturacja w 95 °C przez 15 s, wyżarzanie w 50 °C przez 45 s i przedłużanie w 68 °C przez jedną minutę). Druga amplifikacja PCR została przeprowadzona przy użyciu 3 μl pierwszego produktu PCR i tych samych warunków cyklicznych. Spodziewane szerokie spektrum genotypów HPV wykrywanych z brodawek skórnych przy użyciu starterów HVP2/B5 oraz CN1F/CN1R, CN2F/CN2R, CN3F/CN3R i C4F/C4R obejmuje typy HPV z rodzajów alfa (HPV 2, 3, 7, 10, 27, 28, 29, 40, 43, 57, 77, 91 i 94), gamma (HPV 4, 65, 95, 48, 50, 60 i 88), mu (HPV 1 i 63), i nu (HPV 41) .
Produkty PCR oczyszczano przy użyciu zestawu do oczyszczania PCR (NucleoSpin Extract II PCR Purification Kit, Macherey-Nagel GmbH & Co.KG, Düren, Niemcy) zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie poddawano je reakcji sekwencjonowania Sangera z użyciem BigDye terminator v3.1 cycle sequencing mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) oraz opisanych powyżej starterów nested PCR. Po sekwencjonowaniu przeprowadzono oczyszczanie PCR w celu usunięcia niezwiązanych barwników fluorescencyjnych deoksy terminatorów przy użyciu zestawu BigDye XTerminator™ Purification kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Próbki były denaturowane przez 2 min w 95 °C i natychmiast schładzane na lodzie, a następnie ładowane do analizatora genetycznego ABI 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Próbki poddawano elektroforezie na 50-centymetrowej matrycy kapilarnej z użyciem polimeru POP 6 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) jako medium rozdzielającego.
Próbki analizowano przy użyciu oprogramowania Sequencing Analysis v 3.7 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Wyrównanie sekwencji HPV przeprowadzono z sekwencjami przedstawionymi w bazie danych GenBank przy użyciu oprogramowania BLASTn (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) oraz w bazie danych Los Alamos Data National Laboratory Theoretical Biology and Biophysics HPV (https://pave.niaid.nih.gov/).
Gdy otrzymane sekwencje były słabej jakości z powodu niskiej wydajności produktu PCR, produkty PCR klonowano do wektora pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, WI) po oczyszczeniu zestawem Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega), a sekwencjonowanie insertów wykonywano przy użyciu starterów M13 forward i reverse.
Analiza statystyczna
Dane dotyczące rozpoznania klinicznego, dane demograficzne oraz analiza wirusologiczna zostały zestawione i przeanalizowane przy użyciu oprogramowania statystycznego SPSS „Statistical Package for Social Sciences, SPSS version 25.0” (IBM Corp, Armonk, NY, USA). Obliczono statystyki opisowe: częstości/procenty, miary środka i dyspersji. Do testowania równości średnich zastosowano test t dla dwóch prób dla wszystkich zmiennych ciągłych, gdy zachowana była normalność, w przeciwnym razie zastosowano test U Manna Whitneya. Do porównywania średnich trzech grup zastosowano analizę wariancji lub test Kruskala-Wallisa w zależności od spełnionych założeń. Test chi kwadrat Pearsona dla niezależności lub dokładny test Fishera były używane do testowania asocjacji między dwiema zmiennymi kategorycznymi, gdy założenia były spełnione. W celu modelowania wyniku binarnego z zestawem zmiennych współzmiennych zastosowano regresję logistyczną, a następnie oszacowano surowe i skorygowane ilorazy szans oraz ich 95% przedziały ufności. Wszystkie testy były dwuogonowe, a wartość P mniejsza niż 5% była uważana za statystycznie istotną.