Asocierea genotipurilor HPV cu verucile anogenitale externe: un studiu transversal
Designul studiului și participanții
A fost realizat un studiu transversal care utilizează un eșantion neprobabilistic. Pacienții care frecventează clinicile de dermatologie la Farwania Health District Area au fost recrutați în studiu consecutiv din noiembrie 2016 până în mai 2017. Pacienților imunocompetenți cu diagnostic clinic anterior de veruci anogenitale externe programați pentru crioterapie sau tratament cu laser li s-a cerut să semneze formularul de consimțământ după o explicație verbală din partea medicului dermatolog care le-a solicitat participarea. În momentul prelevării, probele de veruci au fost colectate în mediu de transport universal (HealthLink Inc., Copan Italia S.p.A., Italia) și depozitate la – 80 °C. Aprobarea etică a fost obținută de la Comitetul Etic al Centrului de Științe ale Sănătății (număr: VDR/EC/2310) și de la Ministerul Sănătății.
Informațiile demografice și clinice au fost luate de la fiecare pacient, inclusiv: vârsta (ani), sexul (bărbat, femeie), naționalitatea (kuweitian, non-kuweitian), numărul de negi (unul, între doi și patru și cel puțin cinci), durata prezenței negilor (< o lună, între una și șase luni, între șapte și 12 luni și mai mult de 12 luni), dimensiunea fiecărui neg (în centimetri) (< unul, unul, între unul și doi, mai mult de doi), partenerii au negi (da, nu) și dacă negii au fost supuși unui tratament anterior (da, nu). Niciunul dintre participanți nu a fost vaccinat împotriva HPV, deoarece vaccinarea împotriva HPV nu a fost încă implementată în Kuweit, deși implementarea acesteia este în prezent discutată la Ministerul Sănătății.
Extragerea ADN-ului și controalele
Eșantioanele de țesut primite au fost păstrate la – 80 °C. Din cauza numărului mare de eșantioane primite, toate verucile per pacient au fost tocate împreună și au fost supuse unei singure izolări de ADN. Țesutul a fost tocat cu o foarfecă și un forceps sterile pe o placă Petri și s-au cântărit aproximativ 25-mg de țesut. Țesutul a fost spălat în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) și a fost transferat în tuburi Eppendorf de 1,5 ml. ADN-ul genomic a fost extras din probele de țesut cu ajutorul kitului QIAmp DNA Mini (Qiagen, SUA) în conformitate cu instrucțiunile producătorului.
Vectori HPV tip 2, HPV tip 1 și HPV tip 16 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, SUA) au fost utilizați ca martori în experimentele PCR.
Real time PCR
Aproba PCR în timp real a fost efectuată pentru a depista ADN-ul HPV în verucile genitale. Cinci microlitri (5-μl) de ADN extras au fost combinați cu 12,5-μl de 2X Syber Green master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA) care conține ROX ca referință pasivă și 10 pmol de primeri înainte și înapoi (10-uM, descriși mai jos). Toate seturile de amorse au fost sintetizate la comandă de Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, SUA. Amestecul a fost completat până la un volum de 25 μl cu apă fără nucleaze (Ambion, Austin, TX, SUA). Pentru a reduce numărul de rezultate fals pozitive sau negative, probele au fost analizate în dublu exemplar pe o placă de reacție cu 96 de godeuri optice (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA). Controalele pozitive și negative au fost incluse în fiecare lot de amplificare. Pentru a cuantifica HPV-ul din probe, s-a efectuat o diluție în serie de cinci până la 10 ori a ADN-ului de control pozitiv cunoscut, alături de probe. Amplificarea prin PCR în timp real a fost efectuată în ABI 7500 PCR în timp real (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA).
Analizele PCR în timp real au fost efectuate pe trei plăci diferite. Prima placă a fost utilizată pentru a determina integritatea ADN-ului țintă prin testul PCR β-globină, amplificând un fragment țintă de 268- bp, așa cum a fost descris anterior de Lum și Le Marchand în 1998 . Secvența nucleotidică a amorselor β-globinei este următoarea: Amorsă PCR β-globină înainte: 5′-TGGGTTTCTGATAGGCACTGACT-3′. Amorsă PCR inversă pentru β-globină: 5′-AACAGCATCAGGAGTGGACAGAT-3′.Amplificarea PCR a fost inițiată la 95 °C timp de zece minute și finalizată prin 45 de cicluri de amplificare (denaturare la 95 °C timp de 15 s, recoacere la 55 °C timp de 45 s și extensie la 65 °C timp de un minut).
A doua placă a fost utilizată pentru a depista prezența infecției cu HPV utilizând amorsă MY11/GP6 din ORF-ul HPV L1 . Secvențele nucleotidice ale amorselor MY11/GP6 sunt următoarele: Amorsă înainte MY11: 5′- CGM CAG GGW CAC AAY AAT GG -3′ și amorsă inversă GP6: 5′- GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC-3′. Dimensiunea așteptată a fragmentului amplificat este de 185-bp. Amplificarea PCR a fost inițiată la 95 °C timp de zece minute și finalizată prin 45 de cicluri de amplificare (denaturare la 95 °C timp de 15 s, recoacere la 45 °C timp de 45 s și extensie la 65 °C timp de un minut).
Cea de-a treia placă a fost utilizată pentru depistarea prezenței infecției cu HPV folosind primerii HVP2/B5 din ORF-ul HPV L1 . Secvențele nucleotidice ale amorselor HVP2/B5 sunt următoarele: Amorsă HVP2 înainte: 5′- TCN MGN GGN CAN CCN YTN GG -3′; amorsă B5 inversă: 5′- AYN CCR TTR TTR TGN CCY TG -3′. Dimensiunea așteptată a fragmentului amplificat este de 650-bp. Amplificarea PCR a fost inițiată la 95 °C timp de zece minute și finalizată prin 45 de cicluri de amplificare (denaturare la 95 °C timp de 15 s, aneantizare la 50 °C timp de 45 s și extensie la 65 °C timp de un minut).
Spectrele de fluorescență au fost înregistrate în timpul fazei de elongație a fiecărui ciclu PCR. Sequence Detection Software (SDS v1.7) al ABI 7500 PCR în timp real a fost utilizat pentru a genera curba de amplificare pentru fiecare reacție. O curbă de disociere a fost generată după fiecare reacție pentru a diferenția între ampliconi specifici și nespecifici. Pe baza curbei de amplificare, toate probele cu amplificare HPV începând de la orice ciclu și până la numărul de cicluri 40 (cu o linie de tăiere de 0,2) au fost selectate pentru analiză. Doar probele cu o curbă de disociere între 70 °C și 80 °C și cu o valoare derivată între 0,100-0,500 au fost considerate pozitive la ADN HPV.
Secvențiere Sanger
ADN-ul HPV din veruci a fost amplificat prin nested PCR înainte de secvențiere, folosind AmpliTaq Gold Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA) În prima PCR au fost folosiți primerii HVP2/B5, iar în cea de-a doua PCR, primerii CN1F/CN1R, CN2F/CN2R, CN3F/CN3R și C4F/C4R. Prima amplificare PCR a fost inițiată la 95 °C timp de zece minute și a fost completată de 35 de cicluri de amplificare (denaturare la 95 °C timp de 15 s, recoacere la 50 °C timp de 45 s și prelungire la 68 °C timp de un minut). A doua amplificare PCR a fost efectuată folosind 3 μl din primul produs PCR și aceleași condiții de cicluri. Genotipurile HPV cu spectru larg preconizate a fi detectate din verucile cutanate cu ajutorul primerilor HVP2/B5 și CN1F/CN1R, CN2F/CN2R, CN3F/CN3R și C4F/C4R includ tipuri de HPV din genurile alfa (HPV 2, 3, 7, 10, 27, 28, 29, 40, 43, 57, 77, 91 și 94), gamma (HPV 4, 65, 95, 48, 50, 60 și 88), mu (HPV 1 și 63) și nu (HPV 41) .
Produsele PCR au fost purificate cu ajutorul unui kit de purificare PCR (NucleoSpin Extract II PCR Purification Kit, Macherey-Nagel GmbH & Co.KG, Düren, Germania) conform instrucțiunilor producătorului. Aceștia au fost apoi supuși unei reacții de secvențiere Sanger folosind amestecul de secvențiere a ciclului BigDye terminator v3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA) și primerii nested PCR descriși mai sus. S-au efectuat purificări PCR după secvențiere pentru a elimina terminatorii deoxi-coloranți fluorescenți nelegate cu ajutorul kitului BigDye XTerminator™ Purification (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA). Probele au fost denaturate timp de 2 minute la 95 °C și imediat răcite la gheață și încărcate pe un analizor genetic ABI 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA). Probele au fost electroforezate pe o matrice capilară de 50 cm folosind polimerul POP 6 (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA) ca mediu de separare.
Eșantioanele au fost analizate cu ajutorul software-ului Sequencing Analysis v 3.7 (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA). Alinierea secvenței HPV a fost realizată cu secvențele prezentate în baza de date GenBank utilizând software-ul BLASTn (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) și baza de date HPV a Los Alamos Data National Laboratory Theoretical Biology and Biophysics (https://pave.niaid.nih.gov/).
În cazul în care secvențele obținute au fost de calitate slabă din cauza randamentului scăzut al produsului PCR, produsele PCR au fost clonate în vectorul pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, WI) după purificarea cu kitul Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega), iar secvențierea inserțiilor a fost realizată cu ajutorul primerilor M13 înainte și înapoi.
Analiză statistică
Datele privind diagnosticul clinic, datele demografice și analiza virologică au fost tabelate și analizate cu ajutorul software-ului statistic SPSS „Statistical Package for Social Sciences, SPSS versiunea 25.0” (IBM Corp, Armonk, NY, SUA). Au fost calculate statistici descriptive: frecvențe/percentaje, măsuri de centru și dispersie. Pentru testarea egalității mediilor, s-a utilizat testul t cu două eșantioane pentru toate variabilele continue atunci când s-a respectat normalitatea, în caz contrar s-a utilizat testul U Mann Whitney. Pentru compararea mediilor a trei grupuri, s-a utilizat fie analiza varianței, fie testul Kruskal-Wallis, în funcție de ipotezele care sunt îndeplinite. Testul Pearson chi pătrat pentru independență sau testul Fisher exact au fost utilizate pentru a testa asocierile dintre două variabile categorice atunci când ipotezele au fost îndeplinite. Pentru a modela un rezultat binar cu un set de covariate, a fost implementată regresia logistică și au fost estimate cotele brute și ajustate și intervalele de încredere de 95% ale acestora. Toate testele au fost cu două cozi, iar o valoare P mai mică de 5 % a fost considerată semnificativă din punct de vedere statistic.