Associação de genótipos HPV com verrugas anogenitais externas: um estudo transversal

Desenho do estudo e participantes

Um estudo transversal que utiliza uma amostra não-probabilística foi realizado. Os pacientes que frequentam clínicas de dermatologia na Área Distrital de Saúde de Farwania foram recrutados no estudo consecutivamente de Novembro de 2016 a Maio de 2017. Pacientes imunocompetentes com diagnóstico clínico prévio de verrugas anogenitais externas programadas para crioterapia ou tratamento a laser foram solicitados a assinar o formulário de consentimento após uma explicação verbal do dermatologista solicitando a sua participação. No momento da amostragem, amostras de verrugas foram coletadas em meio de transporte universal (HealthLink Inc., Copan Italia S.p.A., Itália), e armazenadas a – 80 °C. A aprovação ética foi obtida do Comitê de Ética do Centro de Ciências da Saúde (Número: VDR/EC/2310) e do Ministério da Saúde.

Informações demográficas e clínicas foram obtidas de cada paciente, inclusive: idade (anos), sexo (masculino, feminino), nacionalidade (kuwaitiana, não-kuwaitiana), número de verrugas (uma, duas a quatro, e pelo menos cinco), duração da presença de verrugas (< um mês, um a seis meses, sete a 12 meses, e mais de 12 meses), tamanho de cada verruga (em centímetro) (< um, um, entre um e dois, mais de dois), parceiros tem verrugas (sim, não), e se as verrugas foram sujeitas a tratamento prévio (sim, não). Nenhum dos participantes recebeu a vacinação contra o HPV, porque a vacinação contra o HPV ainda não foi implementada no Kuwait, embora sua implementação esteja sendo discutida atualmente no Ministério da Saúde.

Exploração e controles do HPV

Amostras de tecido colhidas foram armazenadas a – 80 °C. Devido ao grande número de amostras recebidas, todas as verrugas por paciente foram picadas em conjunto e submetidas a um isolamento de ADN. O tecido foi picado com tesoura estéril e pinças numa placa de Petri e cerca de 25 mm de tecido foi pesado. O tecido foi lavado em solução salina fosfato tamponada (PBS) e transferido para tubos Eppendorf de 1,5 ml. O DNA genómico foi extraído de amostras de tecido usando um kit QIAmp DNA Mini (Qiagen, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

HPV tipo 2, HPV tipo 1 e HPV tipo 16 vectores (American Type Culture Collection, Manassas, VA, EUA) foram usados como controlos em experiências PCR.

Real time PCR

O ensaio PCR em tempo real foi realizado para rastrear o DNA HPV nas verrugas genitais. Cinco microlitros (5-μl) do DNA extraído foram combinados com 12,5-μl de 2X Syber Green master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) contendo ROX como referência passiva, e 10 pmol de primers forward e reverse (10-uM, descritos abaixo). Todos os conjuntos de primers foram sintetizados por encomenda pela Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA. A mistura foi feita até 25-μl volume com água sem nuclease (Ambion, Austin, TX, EUA). A fim de reduzir o número de resultados falsos positivos ou negativos, as amostras foram analisadas em duplicado em uma placa de reação de 96 poços ópticos (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Controles positivos e negativos foram incluídos em cada lote de amplificação. A fim de quantificar o HPV nas amostras, foi realizada uma diluição serial de cinco a 10 vezes do DNA do controle positivo conhecido, juntamente com as amostras. A amplificação PCR em tempo real foi realizada em ABI 7500 real-time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA).

O ensaio PCR em tempo real foi realizado em três placas diferentes. A primeira placa foi usada para determinar a integridade do DNA alvo pelo ensaio de PCR de β-globina, amplificando um alvo de 268- bp fragmento, como descrito anteriormente por Lum e Le Marchand em 1998 . A sequência nucleotídica dos iniciadores de β-globina é a seguinte: β-globin forward PCR primer: 5′-TGGGTTTTCTGATAGGCACTGACT-3′. β-globin reverse PCR primer: 5′-AACAGCATCAGGGAGTGGACAGAT-3′.A amplificação PCR foi iniciada a 95 °C durante dez minutos e completada por 45 ciclos de amplificação (desnaturação a 95 °C durante 15 s, recozimento a 55 °C durante 45 s e extensão a 65 °C durante um minuto).

A segunda placa foi usada para triagem da presença de infecção por HPV usando primers MY11/GP6 do HPV L1 ORF . As sequências nucleotídicas dos iniciadores MY11/GP6 são as seguintes: MY11 primer forward: 5′- GCM CAG GGW CAC AAY AAT GG -3′ e GP6 primer reverso: 5′- GAAAAATAAACTGTAAATCATTC-3′. O tamanho esperado do fragmento amplificado é 185-bp. A amplificação PCR foi iniciada a 95 °C durante dez minutos e completada por 45 ciclos de amplificação (desnaturação a 95 °C durante 15 s, recozimento a 45 °C durante 45 s e extensão a 65 °C durante um minuto).

A terceira placa foi usada para a triagem da presença de infecção por HPV usando primers HVP2/B5 do HPV L1 ORF . As sequências nucleotídicas dos primers HVP2/B5 são as seguintes: HVP2 primer forward: 5′- TCN MGN GGN CAN CCN YTN GG -3′; B5 primer reverso: 5′- AYN CCR TTR TTR TGN CCY TG -3′. O tamanho esperado do fragmento amplificado é de 650-bp. A amplificação PCR foi iniciada a 95 °C durante dez minutos e completada por 45 ciclos de amplificação (desnaturação a 95 °C durante 15 s, recozimento a 50 °C durante 45 s e extensão a 65 °C durante um minuto).

Espectro de fluorescência foram registados durante a fase de alongamento de cada ciclo de PCR. O Software de Detecção de Sequência (SDS v1.7) da PCR em tempo real ABI 7500 foi utilizado para gerar a curva de amplificação para cada reacção. Uma curva de dissociação foi gerada após cada reação para diferenciar entre amplicons específicos e não específicos. Com base na curva de amplificação, todas as amostras com amplificação HPV começando em qualquer ciclo e até ao ciclo número 40 (com uma linha de corte de 0,2) foram seleccionadas para a análise. Apenas amostras com uma curva de dissociação entre 70 °C e 80 °C e com um valor derivado entre 0,100-0,500 foram consideradas positivas para o DNA do HPV.

Sequenciação de perigo

ADN HPV em verrugas foi amplificado por PCR aninhada antes da sequenciação, usando os primers AmpliTaq Gold Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) HVP2/B5 foram usados na primeira PCR, e os primers CN1F/CN1R, CN2F/CN2R, CN3F/CN3R e C4F/C4R na segunda PCR. A primeira amplificação PCR foi iniciada a 95 °C durante dez minutos e completada por 35 ciclos de amplificação (desnaturação a 95 °C durante 15 s, recozimento a 50 °C durante 45 s e extensão a 68 °C durante um minuto). A segunda amplificação PCR foi efectuada usando 3 μl do primeiro produto PCR, e as mesmas condições de ciclo. Os genótipos HPV de largo espectro esperados a serem detectados a partir de verrugas cutâneas usando HVP2/B5 e CN1F/CN1R, CN2F/CN2R, CN3F/CN3R e primers C4F/C4R incluem tipos HPV dos géneros alfa (HPV 2, 3, 7, 10, 27, 28, 29, 40, 43, 57, 77, 91 e 94), gama (HPV 4, 65, 95, 48, 50, 60 e 88), mu (HPV 1 e 63), e nu (HPV 41) .

Os produtos PCR foram purificados usando um kit de purificação PCR (NucleoSpin Extract II PCR Purification Kit, Macherey-Nagel GmbH & Co.KG, Düren, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Foram depois submetidos à reacção de sequenciação de Sanger usando a mistura de sequenciação do ciclo BigDye v3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), e os iniciadores de PCR aninhados descritos acima. Purificações PCR pós sequenciação foram realizadas para remover terminadores de desoxidação de corantes fluorescentes não ligados usando o BigDye XTerminator™ Kit de purificação (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). As amostras foram desnaturadas durante 2 min a 95 °C e imediatamente refrigeradas em gelo e carregadas num analisador genético ABI 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). As amostras foram eletroforescidas em uma matriz capilar de 50 cm usando polímero POP 6 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) como meio de separação.

As amostras foram analisadas usando o software Sequencing Analysis v 3.7 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). O alinhamento de sequências HPV foi realizado com sequências apresentadas no banco de dados do GenBank usando o software BLASTn (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) e o banco de dados do Los Alamos Data National Laboratory Theoretical Biology and Biophysics HPV (https://pave.niaid.nih.gov/).

Quando as sequências obtidas eram de má qualidade devido ao baixo rendimento do produto PCR, os produtos PCR foram clonados no pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, WI) após a purificação com o Gel SV Wizard e o kit PCR Clean-Up System (Promega), e o sequenciamento dos insertos foi realizado utilizando os primers M13 forward e reverse.

Análise estatística

Dados do diagnóstico clínico, dados demográficos e análise virológica foram tabulados e analisados usando o software estatístico SPSS ‘Statistical Package for Social Sciences, SPSS versão 25.0’ (IBM Corp, Armonk, NY, USA). Estatística descritiva: foram calculadas frequências/percentagens, medidas de centro e dispersão. Para testar a igualdade das médias, foi utilizado o teste t de duas amostras para todas as variáveis contínuas quando a normalidade era mantida, caso contrário, foi utilizado o teste Mann Whitney U. Para a comparação das médias de três grupos, foi utilizada a análise de variância ou o teste de Kruskal-Wallis, dependendo das suposições satisfeitas. O teste de Pearson chi square para independência ou o teste exato de Fisher foram usados para testar associações entre duas variáveis categóricas quando as suposições foram satisfeitas. Para modelar um resultado binário com um conjunto de covariáveis, foi implementada uma regressão logística, e foram estimados os rácios de probabilidade bruta e ajustada e seus intervalos de confiança de 95%. Todos os testes foram dois seguidos e um valor de P inferior a 5% foi considerado estatisticamente significativo.