Frontiers in Cellularand Infection Microbiology

Introduction

Bacteroides fragilis, que se encontra na flora gastrointestinal dos humanos e do gado, é uma bactéria anaeróbia. É uma das comensal humanas proeminentes e uma das mais comuns Bacteroides isoladas das amostras clínicas que causam diarreia, peritonite, abcessos intra-abdominais, sepse e infecções purulentas endógenas (Sears et al, 1995, 2014).

Foi demonstrado que B. fragilis previne doenças inflamatórias intestinais em animais com colite devido à produção de polissacarídeo imunomodulador A (PSA) que induz uma resposta imune anti-inflamatória no tecido intestinal (Mazmanian et al., 2008; Lee et al., 2018). A patogenicidade de B. fragilis deve-se a vários fatores, incluindo a cápsula, proteínas de membrana externa (OMPs) e enzimas especiais que compreendem uma metaloprotease de 20 kDa chamada Bacteroides fragilis toxin (BFT) (Sears et al.., 1995, 2014).

BFT produtora de B. fragilis, B. fragilis enterotoxigénica (ETBF), tem sido conhecida como uma causa de distúrbios diarreicos em humanos e animais (Myers et al., 1987; Purcell et al., 2017). O ETBF é conhecido como fator de risco para doença inflamatória intestinal (DII) e está presente nas fezes e biópsia dos pacientes (Prindiville et al., 2000; Basset et al., 2004; Zamani et al., 2017). A expressão BFT revela-se para clivar o domínio extracelular da E-cadherina, que é um importante constituinte estrutural dos aderentes da zônula e é responsável pela adesão celular. Além disso, o BFT pode ativar a sinalização de B-catenin e induzir secreção de IL8 nas células epiteliais cólicas (Wu et al., 1998). Um estudo indicou que após o tratamento BFT de células HT29/C1, a perda de E-cadherina associada à membrana iniciou a localização nuclear da ß-catenina, o que induziu a tradução c-myc e levou à proliferação celular persistente (Wu et al., 2003). A potência do BFT e sua influência na estrutura epitelial gastrointestinal e na fisiologia sugerem que a presença de ETBF pode contribuir para doenças cólicas crônicas, incluindo transformação oncogênica, inflamação intestinal, disfunções cólicas crônicas e lesões pré-cancerosas e cancerígenas colorrectais (Wu et al, 1998, 2003; Sears et al., 2014).

Câncer colorretal (CRC) é um dos cânceres mais prevalentes no mundo e compreende 9% de todos os cânceres e é a quarta causa de mortes relacionadas ao câncer no mundo (Sears et al., 1995; Ferlay et al., 2015). Contudo, existe uma diferença significativa entre os países na incidência padronizada por idade deste cancro; a taxa de incidência nos EUA e nos países europeus é mais de 25 vezes superior à dos países africanos e asiáticos. A taxa de morbidade e mortalidade do CRC tem diminuído nos últimos anos devido ao aumento dos testes de rastreio que podem detectar modificações colorrectais em fases iniciais e melhorias nos medicamentos e procedimentos (Boyle e Langman, 2000; Rafiemanesh et al, 2016).

CRC é um dos cânceres mais comuns no Irã e é o terceiro câncer mais comum entre os homens iranianos (8,1-8,3 por 100.000 populações) e o quarto câncer mais prevalente entre as mulheres iranianas (6,5-7,5 por 100.000 populações) (Moghimi-Dehkordi et al., 2008; Kolahdoozan et al., 2010). Os fatores de risco de CRC são obesidade, sedentarismo, dieta rica em gordura, dieta pobre em vegetais e frutas, tabagismo, abuso de álcool e antiinflamatórios não-esteróides (AINEs). A inflamação crônica, DII, pólipos, adenoma e displasia causam alterações nas células do cólon e as tornam propensas ao câncer (Boyle e Langman, 2000; Johnson et al., 2013).

A incidência e mortalidade da CRC está diminuindo nas nações ocidentais desenvolvidas, enquanto sua incidência está aumentando entre os dois sexos durante as últimas décadas no Irã devido a mudanças no estilo de vida e na dieta. Outra razão para esta diminuição pode ser o aumento do número de instalações e melhorias em equipamentos e tecnologia, já que mais pessoas se referem a instalações de saúde para triagem, enquanto no passado, uma pessoa pode ter tido um câncer e até mesmo ter morrido, mas o câncer não foi diagnosticado devido à falta de equipamentos e instalações (Malekzadeh et al., 2009; Siegel et al, 2014).

Neste estudo, a frequência e abundância de ETBF em amostras de biópsia dos pacientes com CRC e condições pré-cancerosas foram comparadas às dos indivíduos sem história pessoal ou familiar de doença colorretal para investigar a associação entre a presença de BFT e o desenvolvimento tumoral.

Materiais e Métodos

Patientes e Espécimes

Neste estudo de controle de caso, 120 biópsias de mucosa foram coletadas de pacientes iranianos com condições pré-cancerosas e CRC (n = 68) e grupo controle (n = 52) usando colonoscopia. Pacientes com condições pré-cancerosas (lesões serrilhadas, Adenoma incluem Displasia de baixo grau: LGD e displasia de alto grau: HGD) e condições cancerígenas (câncer colorretal: CRC) que encaminharam ao hospital Imam Khomeini em Teerã entre março de 2015 e janeiro de 2017 foram selecionados para participar deste estudo. O Comitê de Ética da Universidade de Ciências Médicas de Teerã aprovou o protocolo do estudo. Além disso, foi obtido o consentimento informado de todos os participantes. Todos os pacientes foram diagnosticados com base em sintomas clínicos, bem como em padrões histológicos e radiográficos, que mostraram características típicas com distribuição especial (Swiderska et al., 2014). Todos os dados sobre idade, sexo e tipo de lesões foram recuperados dos prontuários dos pacientes. Todos os pacientes que entraram no estudo diagnosticados no momento da colonoscopia e quimioterapia não começaram a tratá-los.

Durante o mesmo período, 52 controles saudáveis, sem história pessoal ou familiar de doença colorretal diagnóstica, cuja idade e sexo coincidiram com os dos pacientes foram incluídos no estudo como controles. Uma história recente de diarréia e DII foi um critério de exclusão para os controles. Nenhum dos indivíduos que participaram deste estudo utilizou qualquer antibiótico ou probiótico nos últimos 3 meses. Todos os espécimes foram mantidos no recipiente esterilizado composto por tioglicolato (Merck, Alemanha) e transportados para o laboratório em condições anaeróbias para manipulação imediata. Além disso, 2 biópsias de mucosa foram coletadas de cada paciente para cultura e extração de DNA.

Cultura de bactérias

Dois homogeneizadores de vidro foram usados para disrupção mecânica e homogeneização para todas as biópsias; então, eles foram cultivados no meio Bacteroides Bile Esculin Agar (BBE) (Himedia Laboratories Pvt. Ltd, Índia). Neste estudo, o sistema Anoxomat (MART Microbiology Drachten, Holanda) foi usado para fornecer condições atmosféricas gasosas para anaeróbios; então, as placas foram incubadas em uma câmara anaeróbica a 37°C por 72 h. Além disso, B. fragilis foi confirmado usando o método de PCR em tempo real.

Exploração de DNA

DNA foi extraído diretamente do tecido da biópsia usando o RTP® Mycobacteria Kit (Invitek, Berlim, Alemanha). A densidade óptica (OD) do ADN extraído foi determinada a 260 nanómetros. Em seguida, o DNA foi preservado a -20°C para análise subsequente e PCR em tempo real.

Real-Time PCR

As sequências do bft e do gene 16S rRNA foram recuperadas do banco de genes. Os primers e sondas foram desenhados usando o primer 3 plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi). Todos os primers e sondas usados para a detecção de todos os tipos de genes bft foram desenhados em nosso estudo anterior (Zamani et al., 2017). A fim de detectar os subtipos do gene bft, a PCR em tempo real foi realizada como descrito anteriormente (Merino et al., 2011).

O DNA genômico da estirpe D-134 de ETBF e o clone 1 de RIGLD foram usados como controles positivos (Rashidan et al., 2018). O controlo negativo foi PCR TaqMan master mix com água destilada em vez de ADN.

ADN padrão foi preparado para amplificação e o número de moléculas do modelo por grama foi calculado pela fórmula definida (Zamani et al., 2017). A curva padrão para bft e 16S gene rRNA foi avaliada usando cada primer e sonda com uma diluição serial 10 vezes maior de amostras de DNA B. fragilis, correspondendo a 101-106 valor médio por grama de biópsias.

De acordo com a curva padrão e o interceptor y, as amostras que não mostraram o sinal fluorescente antes do Ct de 38 foram determinadas como negativas. Também, as amostras que produziram fluorescência de um valor Ct ≤ 10 foram diluídas. A eficácia da PCR em tempo real foi determinada como E = 10(-1/slop) – 1 (Zamani et al., 2017).

Após optimização das curvas padrão, a série de diluições foi colocada em cada série de amplificação. Os testes PCR em tempo real foram avaliados usando a ferramenta de PCR em tempo real LinGene K (Bioer, Hangzhou, PR, China). Todos os testes foram feitos em um volume de 25 μL (Zamani et al., 2017). Para garantir a qualidade, todos os experimentos foram repetidos por uma segunda vez independentemente e as médias foram relatadas.

Para verificar a especificidade da PCR e o tamanho esperado do produto, os primers foram aplicados em uma PCR convencional e os amplicons foram executados sobre o gel de agarose. Além disso, a especificidade dos fragmentos amplificados positivos foi comprovada pelo sequenciamento. O produto PCR foi enviado para a Macrogen Corporation da Coreia do Sul para sequenciação. Os resultados da sequenciação foram analisados com o software Chromas 2.6. Em seguida, todas as sequências foram jateadas na base de dados NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Em todas as sequências isoladas a percentagem de semelhança com os genes relacionados (16s gene rRNA e gene bft) presentes na base de dados NCBI foi superior a 95%.

Análise Estatística

Os resultados foram comparados usando os testes exato de Fisher, Chi square e Mann-Whitney. P < 0,05 foi considerado como estatisticamente significativo. Também foram calculados valores médios ± erro da média (SEM) para B. fragilis e ETBF. Os dados foram analisados utilizando o software estatístico SPSS 13.0.

Neste estudo, foi utilizada regressão logística condicional para avaliar odds ratios (OR) e intervalos de confiança de 95%. Neste desenho, a odds ratio é um estimador consistente da taxa de CRC quando exposto com ETBF vs. sujeitos não expostos.

Resultados

Neste estudo, 68 amostras foram coletadas de pacientes com CRC (36 homens e 32 mulheres; idade média: 55 anos; variação: 35-78) e 52 amostras foram coletadas de controles saudáveis (HC) (30 homens e 22 mulheres; idade média: 56 anos; variação: 42-78). Todos os pacientes foram diagnosticados com base em procedimentos de colonoscopia no momento da coleta da amostra. Todos os pacientes diagnosticados no momento da colonoscopia, dando um total de 26 pacientes com CRC invasivo, 18 pacientes com lesões serrilhadas, 24 pacientes com adenoma incluem 14 pacientes com LGD e 10 pacientes com HGD de acordo com a classificação atual (Figura 1). Estas biópsias foram coletadas do lado direito (ascendente), do lado esquerdo (descendente) e de ambos os lados em 22, 32 e 14 pacientes, respectivamente (Tabela 1).

Os resultados para a cultura de B. fragilis foram positivos para 31(51%) e 25 (48%) amostras dos pacientes e controles saudáveis, respectivamente (Tabela 2) (P = 0,7).

De acordo com a curva padrão, diluições de DNA ETBF (controle positivo) em 101, 102, 103, 104, 105, e 106 forneceram valores Ct de 15,08 ± 0,1, 18,04 ± 0,2, 21,42 ± 0,2, 25,02 ± 0,2, 28,02 ± 0,4, e 31,96 ± 0,4, respectivamente. A eficiência da PCR em tempo real foi entre 98 e 100%.

Amostras positivas para o gene 16S rRNA e o gene bft foram 63 e 47% nos pacientes. Entretanto, resultados positivos foram mostrados em 81 e 3,8% das amostras de HC, respectivamente (Tabela 3). A diferença entre a positividade do gene bft em pacientes e o HC foi estatisticamente significativa (P = 0,00).

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Ainda, o número de amostras positivas de genes bft em CRC e HC dentro dos grupos clinicopatológicos é mostrado na Tabela 3. O OR mais elevado foi encontrado no grupo das lesões serrilhadas seguido por lesões adenomatosas com grupo LGD. Também o OR para todos os pacientes (OR 22,22, IC 95%: 5, 98,74) descreveu a associação de ETBF e a existência de lesões.

Os resultados da análise quantitativa de PCR em tempo real para 16S rRNA genes contados para B. fragilis e bft genes contados para ETBF por ng DNA foram mostrados na Tabela 4. A diferença entre os números de cópias do gene 16S rRNA em pacientes e HC não foi estatisticamente significativa (P ≥ 0,05). Os números de cópias do gene bft foram mais nas amostras de pacientes do que nas de controles saudáveis (P = 0,00). Além disso, o número de cópias do gene bft foi maior nas amostras positivas de ETBF no grupo de lesões precursoras do que nas de CRC; entretanto, essa diferença não foi estatisticamente significante. Os resultados do sequenciamento confirmaram a presença dos genes bft e 16S rRNA (Folha de Dados 1).

Mais, os resultados dessas amostras indicaram que o subtipo mais prevalente do gene bft foi bft1 seguido por bft2. Dos 32 isolados do gene bft, 18 (56,2%) isolados como bft-1 e 14 (43,7%) isolados como bft-2. Além disso, o gene bft foi detectado em 2 amostras de HC, e todos eles foram subtilografados como bft-1. Nenhuma amostra de DNA abrigou o subtipo bft-3,

Discussão

Existem evidências crescentes do efeito da disbiose microbiana no intestino, início e desenvolvimento de câncer colorretal (Sears e Garrett, 2014; Gagniere et al., 2016). Embora a incidência de CRC tenha sido relatada menor no Irã em comparação com outros países, sua taxa foi antecipada para aumentar no futuro (Hosseini et al., 2004; Malekzadeh et al., 2009). Em estudos anteriores, também foi relatado que a ETBF pode ter um papel na diarréia e no IBD (Myers et al., 1987; Prindiville et al., 2000; Basset et al., 2004; Merino et al., 2011; Purcell et al., 2017; Zamani et al, 2017).

Algumas investigações sugeriram que certas espécies bacterianas (por exemplo, ETBF) podem operar como bactérias patogênicas que esclarecem o desenvolvimento de disbiose na comunidade microbiana do intestino e acionar o CRC (Hajishengallis et al., 2012; Hajishengallis e Lamont, 2016). A tumorigenese colorretal foi induzida por respostas imunes e ativação de citocinas pró-inflamatórias devido ao BFT (Wu et al., 2004, 2009).

Os achados deste estudo indicaram que o ETBF estava significativamente associado às lesões serrilhadas seguidas pela LGD. A maior razão de chances nessas lesões também mostrou que a exposição ao ETBF é um fator de risco para os estados cancerígenos e especialmente pré-cancerígenos. Isso suporta a hipótese de que as cepas produtoras de BFT podem ter um papel importante no desencadeamento da inflamação e resposta imunológica em pessoas geneticamente suscetíveis e podem levar à CRC. O primeiro estudo demonstrou um aumento da prevalência de ETBF nas fezes de pacientes com câncer colorretal (38%) em comparação com o grupo controle (12%) conduzido por Ulger Toprak et al. (2006). Além disso, alguns relatórios anteriores mostraram uma associação entre o gene bft e o CRC, particularmente na fase final do CRC (Dejea et al., 2014; Boleij et al., 2015; Viljoen et al., 2015). Um estudo conduzido por Purcell et al. demonstrou associações significativas de ETBF com adenomas tubulares, lesões serrilhadas e displasia de baixo grau, que foi semelhante aos resultados do presente estudo (Purcell et al., 2017).

Neste estudo, as lesões precursoras, incluindo aquelas com displasia de baixo grau, mostraram uma tendência crescente na quantidade do gene bft em comparação com aquelas com CRC; entretanto, esta diferença não foi estatisticamente significativa. Além disso, os autores relataram anteriormente que foram observados marcadores de ETBF no cólon e no íleo terminal dos pacientes com colite ulcerativa predispostos ao CRC (Zamani et al., 2017; Rashidan et al., 2018). Da mesma forma, em um estudo anterior, apenas o subtipo bft1 deste gene foi detectado (Zamani et al., 2017). Embora o gene bft1 fosse o subtipo mais prevalente, o gene bft2 também foi encontrado neste estudo.

Neste estudo, o ETBF foi detectado nas lesões dos pacientes CRC, e resultados similares também foram relatados anteriormente por outros investigadores que estudaram o ETBF em amostras de mucosa cólica (Boleij et al., 2015; Viljoen et al., 2015). Estudos recentes sobre o papel do microbioma intestinal demonstraram que a disbiose na comunidade microbiana ocorre nas regiões não tumorais e tumorais dos pacientes CRC (Dejea et al., 2014; Flemer et al., 2017; Purcell et al., 2017). Nestes estudos, algumas das bactérias incluindo Fusobacterium nucleatum, ETBF, Escherichia coli, Streptococcus gallolyticus, e Enterococcus faecalis e bactérias produtoras de butirato podem desempenhar papéis importantes no desenvolvimento do CRC (Dejea et al.., 2014; Flemer et al., 2017; Park et al., 2018).

Os resultados da PCR em tempo real para detecção de B. fragilis mostraram que mais percentagem dos pacientes e HC continham B. fragilis em comparação com o método de cultura. O método padrão-ouro para detecção de bactérias é baseado em cultura, mas requer um alto número de células viáveis e especificamente para cultura bacteriana anaeróbica, algumas limitações podem ocorrer. Podem ser estas limitações que afetam a diferença entre os resultados.

As diferenças nas culturas de B. fragilis e nos resultados de PCR em tempo real entre amostras de controle e de CRC não é significativa. Estes dados sugerem que provavelmente as cepas que abrigam o gene bft, e não B. fragilis por si só, poderiam contribuir para o CRC neste estudo. Foi demonstrado que a B. fragilis é um comensal humano proeminente, por isso esta bactéria pode ser isolada de controles saudáveis como os pacientes também. Mas nos pacientes com lesões cancerosas e pré-cancerosas, algumas das estirpes que contêm genes de bft aumentaram e esta disbiose provavelmente pode induzir inflamação. Além disso, alguns estudos mostraram que a B. fragilis comensal humana impediu o desenvolvimento de colite e pode fornecer uma estratégia terapêutica eficaz para a CRC, enquanto vários estudos sugerem que cepas enterotoxigênicas desta bactéria estão associadas a tumores intestinais devido à produção de enterotoxinas (Sears et al., 1995, 2014; Mazmanian et al., 2008; Lee et al., 2018).

Existiram algumas limitações neste estudo. Diferentes métodos foram utilizados para diagnosticar o gene bft, que foi extraído diretamente dos tecidos tumorais no cólon dos pacientes. Assim, a realização de um grande estudo de coorte de base populacional é altamente recomendada. Além disso, investigações adicionais são necessárias para provar uma possível correlação entre a presença do gene bft e lesões serrilhadas, LGD e CRC.

Conclusões

Resultados deste estudo sugerem que o ETBF poderia estar presente nas biópsias de mucosa dos pacientes com condições pré-cancerosas, como lesões serrilhadas e LGD, além dos pacientes com CRC. Foi encontrada uma associação significativa entre a presença de ETBF nos tecidos afetados e o número destas bactérias nas amostras dos pacientes, especialmente nas lesões pré-cancerosas cancerígenas: adenomas com displasia de baixo grau e lesões serrilhadas. Na verdade, o ETBF é mais frequentemente detectado em lesões precoces, mas mais pesquisas com maior número de espécimes parecem ser úteis para determinar com precisão.

Também são necessárias pesquisas adicionais para determinar se a idade, sexo, dieta e outros fatores ambientais afetam o diagnóstico de ETBF em humanos ao longo do tempo.

Finalmente, o ETBF poderia ser um marcador do prognóstico do CRC, particularmente nas lesões pré-cancerosas, e poderia ser usado para triagem desses distúrbios.

Data Availability Statement

Os dados brutos que suportam as conclusões deste manuscrito serão disponibilizados pelos autores, sem reservas indevidas, a qualquer pesquisador qualificado.

Ethics Statement

Os estudos envolvendo participantes humanos foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de Teerã de Ciências Médicas. Os pacientes/participantes deram seu consentimento livre e esclarecido por escrito para participar deste estudo.

Contribuições dos autores

SZ é o primeiro autor que realizou todos os experimentos laboratoriais, coletou e analisou dados e redigiu o manuscrito. RT é o gastroenterologista que fez a colonoscopia e forneceu os espécimes de todos os casos. LS participou no desenho e coordenação do estudo e aconselhou em todas as partes do estudo. AS e SJ participaram na coleta das amostras e na realização dos testes. A MF supervisionou todas as partes do estudo. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito.

Funding

Este trabalho foi apoiado pela Universidade de Ciências Médicas de Teerã (Grant No: 32467).

Conflito de Interesses

Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

Confirmações

Os autores gostariam de agradecer ao pessoal do hospital Imam Khomeini pelo seu gentil apoio na coleta das amostras.

Material Suplementar

O Material Suplementar para este artigo pode ser encontrado online em: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcimb.2019.00449/full#supplementary-material

Folha de Dados 1. Os resultados do sequenciamento dos genes bft e 16S rRNA em um isolado.